【摘要】：肺癌的發(fā)病率和死亡率居于惡性腫瘤的首位,化療在肺癌防治過程中一直處于主導(dǎo)地位,積極開發(fā)有效的肺癌防治藥物尤為重要。炎性反應(yīng)是腫瘤的十大特征之一,其中中性粒細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的炎性細(xì)胞,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用已經(jīng)受到了廣泛重視。中性粒細(xì)胞在不同的腫瘤微環(huán)境中可以極化為促癌和抑癌兩種表型。最近研究表明:高凝狀態(tài)所造成的肺栓塞大大縮短了肺癌患者的生存期,成為肺癌患者的第二大死因,而腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TANs)活化后形成的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)是造成肺癌相關(guān)高凝狀態(tài)以及血栓形成的主要原因。然而,中性粒細(xì)胞和高凝狀態(tài)與肺癌發(fā)生之間的關(guān)系尚不明確。大黃素是大黃的有效成分之一,具有抗炎和抗腫瘤等多種藥理活性,其防治腫瘤作用是否與影響中性粒細(xì)胞表型相關(guān)未有報(bào)道。本研究目的是探究中性粒細(xì)胞和高凝狀態(tài)與肺癌發(fā)生的關(guān)系,以及大黃素是否能影響中性粒細(xì)胞表型防治高凝和肺癌及其作用機(jī)制。本研究分體內(nèi),體外和機(jī)制研究三個(gè)部分。在體外研究中,用ATRA誘導(dǎo)HL-60分化為HL-60N1,繼續(xù)用TGF-β誘導(dǎo)HL-60N1分化為HL-60N2,獲取兩種表型的中性粒細(xì)胞,以不同濃度的大黃素處理HL-60N1和HL-60N2,MTT法檢測大黃素對細(xì)胞增殖的影響;Annexin V-FITC/PI染色檢測大黃素對細(xì)胞凋亡的影響;激光全息檢測大黃素對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞體積的影響;中性紅攝取檢測大黃素對細(xì)胞攝取能力的影響。在體內(nèi)研究中,建立烏拉坦致肺癌模型,檢測肺癌發(fā)生發(fā)展過程中凝血狀態(tài)及肺泡中性粒細(xì)胞的數(shù)目、CD66b的表達(dá)和NETs形成的變化;采用HE染色檢測小鼠肺組織病理變化,評價(jià)大黃素對肺癌的防治效果,并檢測大黃素在肺癌的防治過程中凝血狀態(tài)及中性粒細(xì)胞數(shù)量和表型變化;采用Ly6G mAb耗竭中性粒細(xì)胞,分析中性粒細(xì)胞在肺癌發(fā)生過程中的作用,以及和大黃素合用的效果。建立LLC異位移植瘤模型,檢測過繼性輸注HL-60N1和HL-60N2細(xì)胞對腫瘤生長的作用,免疫印記法檢測瘤組織內(nèi)中性粒細(xì)胞MPO、CD66b的表達(dá),探究大黃素在治療腫瘤過程中對中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用和高凝防治作用。為了進(jìn)一步探索大黃素調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞防治高凝狀態(tài)和肺癌的機(jī)制,在體外實(shí)驗(yàn)中,檢測大黃素對HL-60N1和HL-60N2細(xì)胞CD66b表達(dá)、NETs形成、吞噬作用、自噬能力和ROS產(chǎn)生的影響,評價(jià)大黃素對中性粒細(xì)胞表型和功能的影響。在烏拉坦肺癌模型中,免疫組化檢測大黃素對烏拉坦誘導(dǎo)肺癌小鼠肺組織中性粒細(xì)胞表型標(biāo)志物(Ly6G和CD66b)和NETs形成標(biāo)志物(PAD4和CitH3)表達(dá)的影響;ELISA檢測肺泡細(xì)胞因子IFN-γ,IL-12、ROS、IL-6,TNF-α和TGF-β1的表達(dá)。最后,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測并解釋大黃素調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞防治高凝和肺癌的分子機(jī)制。體外結(jié)果顯示,HL-60經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后分葉核明顯,經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)后細(xì)胞體積增大,CD66b表達(dá)增多;大黃素在20μM時(shí),對HL-60N1細(xì)胞活性幾乎無影響,但可以促進(jìn)HL-60N1細(xì)胞對中性紅的攝取;對HL-60N2細(xì)胞,大黃素抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并伴隨著細(xì)胞體積的減小。體內(nèi)結(jié)果顯示,在烏拉坦肺癌模型中,肺組織癌變前,小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了高凝狀態(tài)和N2型中性粒細(xì)胞增多;在肺癌發(fā)生后,N2型中性粒細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增多,凝血持續(xù)加重;大黃素治療后,肺組織結(jié)節(jié)數(shù)目,癌變面積明顯減小,高凝狀態(tài)得到改善,肺泡N2型中性粒細(xì)胞聚集和NETs形成明顯減少。Ly6G mAb耗竭中性粒細(xì)胞可以改善高凝狀態(tài)并防治肺癌,但減弱大黃素對肺癌的防治作用。在LLC異位移植瘤模型中,大黃素阻止過繼性輸注HL-60N2細(xì)胞的促凝和促腫瘤作用,與過繼性輸注HL-60N1協(xié)同抑制腫瘤生長,免疫印記結(jié)果顯示,大黃素促進(jìn)瘤組織中性粒細(xì)胞MPO的表達(dá),抑制CD66b的表達(dá)。機(jī)制研究表明,大黃素在體外促進(jìn)HL-60N1細(xì)胞的吞噬作用、增加活性氧的產(chǎn)生;對于HL-60N2細(xì)胞,大黃素降低CD66b的表達(dá)和NETs的形成,抑制自噬能力。在烏拉坦肺癌模型中,大黃素可以抑制肺組織中性粒細(xì)胞CD66b、PAD4和Cit-H3的表達(dá);ELISA檢測結(jié)果顯示大黃素升高肺泡中IFN-γ、IL-12和ROS水平,降低IL-6、TNF-α和TGF-β1水平。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明,大黃素通過調(diào)節(jié)Jak-Stat,Toll樣受體等信號通路,抑制TANs自噬,使NETosis這一生物過程轉(zhuǎn)化為凋亡,從而逆轉(zhuǎn)TANs的促凝和促癌效應(yīng)。綜上所述,中性粒細(xì)胞增多癥和高凝狀態(tài)與烏拉坦肺癌進(jìn)展呈正相關(guān);CD66b~+中性粒細(xì)胞(N2)在肺組織的聚集和NETs所造成的高凝狀態(tài)共同導(dǎo)致了肺癌的發(fā)生;大黃素選擇性抑制N2中性粒細(xì)胞的激活,并保留N1中性粒細(xì)胞防治高凝和肺癌。
【圖文】：

每孔繼續(xù)加入 0.1 mL 的 0.072%中性紅溶液，30 min 后用 96 孔板離心機(jī)離心，棄上清，PBS 洗 3 次，每次 3 min，接著每孔加入細(xì)胞溶解液（乙酸：無水乙醇=1：1）100uL，靜置 6-8h，酶標(biāo)儀測在 540 nm 處的 OD 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。2.3.6 數(shù)據(jù)分析使用 GraphPad Prism 7.0 版軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間的差異用 t 檢驗(yàn)來進(jìn)行評價(jià)。*P <0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，，**P <0.01 為極顯著差異。2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1 HL-60 分化為 HL-60N1 和 HL-60N2 的檢測HL-60 細(xì)胞核較大，無分頁核，經(jīng)過 ATRA 誘導(dǎo) 7 天后，出現(xiàn)分頁核（如圖 2-1），CD66b 的表達(dá)變化無明顯變化（如圖 2-2）；又經(jīng)過 TGF-β誘導(dǎo)后細(xì)胞核分頁更明顯、體積增大（如圖 2-1），CD66b 的表達(dá)明顯增加（如圖 2-2）。

圖 2-2 細(xì)胞 CD66b 的表達(dá)Fig.2-2 The CD66b expression of cells2.4.2 大黃素對 HL-60N1 和 HL-60N2 細(xì)胞增殖能力的影響大黃素在低濃度時(shí)對 HL-60N1 的增殖能力影響較小，在 20 μM 以下對 HL-60N1的增殖能力幾乎無影響，在 40 μM 時(shí)出現(xiàn)抑制作用。大黃素在 20 μM 可以明顯抑制HL-60N2 的增殖，并呈劑量依賴性（如圖 2-3）。（*P < 0.05， **P < 0.01 vs HL-60N1）。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2691135