【摘要】：目的:觀察獨活香豆素對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞活性和炎癥因子IL-1β、TNF-α的影響,探討?yīng)毣钕愣顾貙ι窠?jīng)元樣PC12細胞保護作用的機制,為獨活香豆素治療帕金森病提供實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。材料與方法:1.含藥血清制備:應(yīng)用隨機法,將大鼠分四組為:正常組(20只)、吐溫80組(10只)、塞來昔布組(10只)、獨活香豆素組(10只)。正常組大鼠予生理鹽水灌胃,吐溫80組予0.08%吐溫80,2ml/次,塞來昔布和獨活香豆素組大鼠給藥劑量按照人與大鼠給藥劑量換算公式進行計算,塞來昔布組按照說明書中成人每天常規(guī)用量進行折算,獨活香豆素組大鼠實際給藥量按照成人每天10g獨活飲片的3倍~([8])量進行折算。給藥時間為上午8∶00~10∶00,每日1次,2ml/次/只,連續(xù)給藥7天。最后一次給藥2h后腹主動脈取血,靜置2h,2000r/min離心10min后分離血清。經(jīng)56℃,30min滅活,0.22μm濾膜過濾滅菌,放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.PC12細胞分化與培養(yǎng):大鼠腎上腺嗜鉻細胞(PC12)經(jīng)神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣PC12細胞,然后選擇含15%馬血清的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng),取對數(shù)生長期,按照1×10~5/ml密度,接種于96孔板中培養(yǎng),100μl體系,待培養(yǎng)24小時細胞貼壁生長后,進行Lactacystin與含藥血清濃度的篩選。3.Lactacystin作用濃度的確定:將Lactacystin配制成1mmol/l的母液,然后將Lactacystin母液稀釋為0μmol/l、5μmol/l、10μmol/l和20μmol/l終濃度加入到細胞培養(yǎng)基中,作用時間為24h,通過MTT檢測各組細胞相對存活率,最后確定Lactacystin誘導(dǎo)神經(jīng)元樣PC12細胞作為帕金森病細胞模型的最佳作用濃度為5μmol/l。4.含藥血清作用濃度及時間的確定:取對數(shù)生長期的神經(jīng)元樣PC12細胞,按照1×10~5/ml密度,接種于96孔板中培養(yǎng),100μl體系,待培養(yǎng)24小時細胞貼壁生長后,將細胞共分成16組,分別為空白對照組(馬血清)、正常對照血清組、模型血清組、吐溫血清組、塞來昔布血清組、獨活香豆素血清組,再將除空白對照組以外的含藥血清組分為10%、15%、20%三個濃度組,更換相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基,保護時間分別為24h、48h后,除空白對照組和正常血清對照組外,其余各組分別加入5μmol/l Lactacystin作用24h。最后應(yīng)用MTT檢測細胞相對存活率,確定最佳含藥血清濃度為15%,最佳的作用時間為24h。5.分組與給藥:實驗分為五組,分別為正常對照組、模型組、吐溫組、塞來昔布組、獨活香豆素組。按照以1×10~5/ml的密度將對數(shù)生長期的PC12細胞一部分接種于兩個96孔板中培養(yǎng),同時一部分接種于6孔板中培養(yǎng),分別選取濃度為15%不同的含藥血清培養(yǎng)24h后,除了正常對照組外其余各組分別加入5μmol/l Lactacystin,24h后收集細胞及細胞上清液。6.指標檢測及統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用MTT檢測各組細胞活性。應(yīng)用ELISA法檢測IL-1β、TNF-α的蛋白含量。應(yīng)用RT-PCR法檢測IL-1β、TNF-α的mRNA表達。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析統(tǒng)計,所有實驗數(shù)據(jù)均采用x±S表示多組間實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,以p0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:1.Lactacystin作用濃度的確定結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MTT法測定的吸光度值均隨著Lactacystin濃度增加而逐漸降低,即Lactacystin有明顯劑量依賴性地抑制細胞活性的作用。當(dāng)Lactacystin作用濃度為5μmol/l時,細胞相對存活率最高。因此選擇濃度為5μmol/l,作用24h為誘導(dǎo)神經(jīng)元樣PC12細胞的刺激條件。2.含藥血清作用時間和濃度的確定經(jīng)篩選確定5μmol/lLactacystin作用24h作為刺激條件。用不同濃度的含藥血清對細胞進行干預(yù)保護,與不同濃度的模型組相比,實驗結(jié)果顯示15%含藥血清保護24h、48h,細胞OD值及相對存活率顯著性增高(p0.01),而15%濃度含藥血清保護24h細胞OD值及相對存活率高于48h。本著相對存活率最高的最低血清濃度的原則,最終選用15%濃度含藥血清保護24h作為最佳條件。3.各組血清對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞活性的影響通過MTT檢測模型組細胞活性情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):模型組與吐溫80組之間細胞OD值無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);模型組和吐溫組細胞OD值顯著低于正常對照組(p0.01)。獨活香豆素組細胞OD值高于模型組(p0.01)、吐溫80組(p0.01)和塞來昔布組(p0.01),但低于正常對照組(p0.01);塞來昔布組細胞OD值高于模型組(p0.01)和吐溫80組(p0.01),但低于正常對照組(p0.01)和獨活香豆素組(p0.01)。4.各組血清對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達的影響4.1Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達的影響結(jié)果顯示:模型組與吐溫80組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);與正常對照組相比,模型組細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達均顯著升高(p0.01)。4.2塞來昔布對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達的影響結(jié)果顯示:塞來昔布組細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達均低于模型組(p0.01),而細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達均高于獨活香豆素組(p0.01)。4.3獨活香豆素對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達的影響結(jié)果顯示:獨活香豆素組與模型組相比,細胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達均顯著下降(p0.01),與塞來昔布組相比IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達均低于塞來昔布組(p0.01)。結(jié)論:1.本實驗應(yīng)用Lactacystin蛋白酶體抑制劑,成功模擬出帕金森病神經(jīng)元細胞損傷模型。模型組神經(jīng)元樣PC12細胞活性下降,炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表達均升高。2.獨活香豆素含藥血清能促進Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞增殖;且獨活香豆素含藥血清能夠下調(diào)Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表達。3.獨活香豆素含藥血清對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞具有保護作用,與其下調(diào)細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表達,抑制Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細胞的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2690863