【摘要】：世界衛(wèi)生組織明確將肥胖列為疾病的一種。肥胖可引發(fā)糖尿病、高血壓、心功能受損、癌癥等多種疾病,且對人類造成的威脅日益劇增,嚴重威脅著各個年齡段肥胖人群的健康。因此,對肥胖產(chǎn)生機制和治療研究成為科研領(lǐng)域迫切渴望解決的難題。藥物靶標是藥物研發(fā)重中之重,為疾病治療提供新途徑,為藥物篩選提供新突破口。近年來,科學(xué)領(lǐng)域不斷發(fā)展,隨之也產(chǎn)生了一些新興的藥物靶標找尋技術(shù),給肥胖癥患者帶來了福音。本課題主要對連翹苷的減肥靶標進行了初步識別與驗證。首先在細胞水平上對連翹苷的減肥作用進行了確認;其次運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對連翹苷潛在減肥作用靶標進行預(yù)測;然后一方面用DARTS技術(shù)結(jié)合電泳實驗找尋連翹苷靶標,另一方面用分子對接技術(shù)研究了連翹苷與PDE3B的相互作用;最后基于上述研究結(jié)果及文獻調(diào)研推測連翹苷的減肥靶標可能為PDE3B,并分別從細胞水平與分子水平對其展開驗證實驗。主要研究內(nèi)容和實驗結(jié)果總結(jié)如下:1.連翹苷減肥作用確認。主要利用MTT法、熒光染色法進行研究。結(jié)果表明:當(dāng)濃度為1-100μM時,連翹苷對HepG2細胞存活率無影響。用DMEM高糖培養(yǎng)基(30 mM D-glucose)孵育HepG2細胞,構(gòu)建脂滴累積細胞模型,然后用不同濃度連翹苷孵育細胞,用尼羅紅對HepG2肝細胞進行染色,發(fā)現(xiàn)HepG2細胞熒光強度隨著連翹苷濃度(1.25、2.5、5μM)的增加有所減弱,當(dāng)連翹苷濃度≥5μM時,HepG2細胞熒光強度基本保持不變。以上研究表明連翹苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HepG2肝細胞中脂滴的積累,即在細胞水平上連翹苷確實具有減肥作用。2.連翹苷潛在減肥作用靶標的虛擬篩選。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一信息學(xué)手段進行靶標篩選。首先依據(jù)反向藥效團匹配方法預(yù)測連翹苷靶點(成分靶點),然后與GeneCards與CooLGeN數(shù)據(jù)庫篩選得到的肥胖靶點(疾病靶點)比對分析,采用Cytoscape軟件構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,采用ClueGO軟件對靶點進行GO分類富集分析與KEGG通路分析。結(jié)果表明:網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中共得到27個連翹苷潛在減肥作用靶點,其中PDE3B即是27個靶點之一。GO分類富集中,生物過程分析表明其主要參與調(diào)節(jié)纖維細胞增殖、胰液分泌、一氧化氮介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、超氧化物代謝、I-κB激酶/NF-κB信號傳導(dǎo)、維甲酸受體信號、脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、殼聚糖的分泌與運輸?shù)认嚓P(guān)生物過程;分子功能分析表明相關(guān)靶點主要參與核受體活動,影響氧化還原酶活性,作為受體參與過氧化作用,與類視黃醇X受體結(jié)合等分子功能。KEGG通路分析表明,預(yù)測的靶點涉及小細胞肺癌通路與脂肪細胞脂解調(diào)控通路。3.連翹苷減肥作用靶標實驗篩選。首先采用DARTS技術(shù),結(jié)合SDS-PAGE電泳進行靶標識別,分別從鏈霉蛋白酶E的濃度、水解時長、水解溫度等方面探索連翹苷的靶標蛋白,其次運用分子對接研究連翹苷與PDE3B相互作用。DARTS/SDS-PAGE結(jié)果顯示:電泳條帶中未能觀察到明顯的蛋白濃度差異條帶,主要歸因于DARTS技術(shù)較難找到低豐度靶蛋白,經(jīng)文獻調(diào)研并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果,推測PDE3B可能為連翹苷潛在減肥作用靶標。分子對接結(jié)果表明,一方面連翹苷與PDE3B的Total-Score大于米力農(nóng)(milrinone,PDE3抑制劑),另一方面連翹苷與PDE3B之間有7個氫鍵形成,而米力農(nóng)與PDE3B間無氫鍵形成。因此,連翹苷極有可能為PDE3B潛在抑制劑。4.連翹苷減肥作用靶標驗證(PDE3B)。分別從細胞水平和分子水平展開驗證。細胞水平上首先對連翹苷和米力農(nóng)競爭同一靶標PDE3B進行實驗驗證,其次用ELISA試劑盒法對連翹苷是否能抑制靶標PDE3B,從而可提高cAMP含量進行驗證;分子水平上合成PDE3B基因,構(gòu)建pET-28a-PDE3B重組質(zhì)粒,對PDE3B蛋白表達、復(fù)性、純化和驗證實驗進行了初步探索。結(jié)果表明:細胞水平上,米力農(nóng)抑制HepG2肝細胞中脂質(zhì)的積累,并且連翹苷與米力農(nóng)競爭同一活性位點;同時,連翹苷能夠增加肝細胞中的cAMP含量。因此,連翹苷可能是PDE3B的潛在抑制劑,即PDE3B可能是連翹苷的減肥靶標。分子水平上,由于PDE3B中疏水氨基酸較多,在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中對重組質(zhì)粒分別進行IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度以及Ca~(2+)濃度等條件考察后,結(jié)果表明其主要以包涵體形式存在,由于PDE3B蛋白變性后復(fù)性較為困難,分子水平驗證實驗仍在進行中。
【圖文】：

第一章 綜述子化合物。研究者利用 FK506 和雷帕霉素（Rapamycin）免疫抑制劑 K506 結(jié)合蛋白12（FKBP12）進行驗證，經(jīng)枯草桿菌蛋白酶水解后，與對照組相比，與 rapamycin或者 FK506 結(jié)合后的 FKBP12 的蛋白條帶較寬，較明顯，即沒有被水解或水解較少，從而驗證了 DARTS 技術(shù)的正確性。但研究者考慮到 rapamycin 或者 FK506 是一種可以獲得的特定的、高效的藥物（活性小分子化合物），且與 FKBP12 結(jié)合活性較強，所以研究者決定檢測 DARTS 這一技術(shù)是否仍適用于一種更弱的抑制劑，又采用 E4與其目標蛋白 mTOR 相互作用，從其具有抗嗜熱菌蛋白酶的水解實驗中再一次證明了這一靶標辨識技術(shù)手段的可行性。由此 DARTS 技術(shù)在藥物靶標找尋中漸漸被人們熟知起來。AB

酶（Phosphodiesterases，PDEs）在動植物細胞和微生要作用，它與腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate Cyclase，AC著細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（CyclicAdenosine Monophospha一種環(huán)狀核苷酸，當(dāng)外來信號刺激細胞表面并經(jīng)跨膜傳信號分子與細胞表面的受體結(jié)合形成復(fù)合體，從而進，被激活的 Gs 蛋白再進一步激活細胞膜上的 AC，AC 合形成 cAMP。cAMP 是細胞內(nèi)的第二信使，它能夠aseA，PKA，cAMP 依賴性蛋白激酶），使相應(yīng)的靶細相關(guān)細胞反應(yīng)的作用。發(fā)揮作用后的 cAMP 會進一步被Adenosine-5’-Monophosphate，5’-AMP）而失活[62]，從的生化作用。與此同時，，PDEs 也能夠調(diào)節(jié)細胞中第二nosine Monophosphate，cGMP）的濃度（具體過程見圖
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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6 張輝;宋文靜;潘U

本文編號：2664505