【摘要】：目的:本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,復(fù)制糖尿病神經(jīng)源性膀胱大鼠模型,運(yùn)用高通量、高密度、高特異性的蛋白芯片技術(shù),探討加味五苓散干預(yù)糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型大鼠的可能作用機(jī)制,為研究中藥復(fù)方的多途徑、多靶點(diǎn)治療特點(diǎn)提供可視化的思路。方法:1.分組與造模將55只體重160-180g的雌性SD大鼠檢疫合格并適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后,測(cè)量其體重和血糖,無(wú)明顯差異,將55只大鼠編號(hào),按隨機(jī)表法分為空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱Control,n=8)、模型組(簡(jiǎn)稱Model,n=15)、加味五苓散組(簡(jiǎn)稱CHM,n=16)、氯貝膽堿組(簡(jiǎn)稱WM,n=16),空白組繼續(xù)普通喂養(yǎng),其余各組大鼠改用高脂高糖飼養(yǎng),8w后模型組、加味五苓散組、氯貝膽堿組大鼠腹腔注射STZ造糖尿病模型,空白組注射相應(yīng)劑量的生理鹽水,3d后測(cè)量血糖≥16.7mmol/L的為糖尿病造模成功,未成功或死亡的大鼠摒棄,其余三組大鼠繼續(xù)以高脂高糖飼料喂養(yǎng)16w后進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè),確定糖尿病神經(jīng)源性膀胱模型造模是否成功。2.藥物干預(yù)根據(jù)動(dòng)物公斤體重系數(shù)法算出加味五苓散組和氯貝膽堿組的給藥劑量,空白組和模型組給予同體積的蒸餾水。四組給藥方式均為灌胃,16w尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完畢后進(jìn)行,持續(xù)4w。3.取材與檢測(cè)(1)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行血糖、體重、尿量測(cè)量,比較組間和組內(nèi)差異,觀察動(dòng)物的一般狀態(tài),輔助判斷大鼠造模成功與否,藥物干預(yù)前后進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè),確定大鼠造模成功與否及初步判斷藥物干預(yù)效果。(2)尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完成后,進(jìn)行取血,將膀胱組織固定在4%的多聚甲醛固定液中保存,酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后,將膀胱組織蠟塊切成約3-4μm的切片,進(jìn)行HE染色。(3)血液室溫下靜置4h后離心取血清,采用RayBiotech試劑盒進(jìn)行檢測(cè),用GSR-CAA-67蛋白芯片技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(4)對(duì)大鼠血清蛋白芯片的結(jié)果進(jìn)行Elisa驗(yàn)證分析。結(jié)果:1.造模:(1)一般狀態(tài):未經(jīng)STZ腹腔注射造模的空白組大鼠精神飽滿,反應(yīng)靈敏,進(jìn)食量、進(jìn)水量與體重均穩(wěn)步增長(zhǎng),毛色潔白有光澤,未見(jiàn)脫毛現(xiàn)象,眼睛明亮有神,大便質(zhì)地較硬,尿量較少,無(wú)明顯臭味。模型組、加味五苓散組、氯貝膽堿組大鼠精神較萎靡,糖尿病造模后開(kāi)始階段性情暴躁,同籠撕咬嚴(yán)重,后期則反應(yīng)遲鈍,多飲、多食、形體消瘦,毛色萎黃無(wú)光澤,且有片狀脫毛現(xiàn)象,以頸部和脊背較嚴(yán)重,有三只大鼠眼睛出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變,眼珠呈灰白色,大便溏泄且便量增多,尿液酸臭且渾濁,尿量多。(2)造模后模型組、中藥組與西藥組大鼠血糖升高,平均值均大于16.7mmol/L,提示糖尿病模型造模成功。(3)與空白組大鼠體重持續(xù)上升相比,模型組、加味五苓散組和氯貝膽堿組大鼠體重呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),與造模后糖尿病引起的消瘦有關(guān)。(4)尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè):四組的膀胱漏尿點(diǎn)壓(BLPP)和最大排尿壓(MVP)值,沒(méi)有顯著性差異,P0.05,與空白組相比,模型組、中藥組與西藥組尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)指標(biāo)中的殘余尿量(RV)增多、最大膀胱容量(VE)降低、排尿率(MBC)與膀胱順應(yīng)性增高,具有顯著性差異,P0.05,模型組與中藥組、西藥組之間沒(méi)有顯著性差異,P0.05。2.加味五苓散對(duì)DNB大鼠的作用:(1)尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè):糖尿病病程16w,四組的BLPP和MVP相互之間沒(méi)有顯著性差異,P0.05,與空白對(duì)照組相比,模型組、加味五苓散組與氯貝膽堿組尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)指標(biāo)中的RV增多、VE降低、MBC與膀胱順應(yīng)性增高,顯著性差異P0.05或P0.01,模型組與加味五苓散組、氯貝膽堿組之間沒(méi)有顯著性差異,P0.05。說(shuō)明在糖尿病病程16w時(shí),DNB大鼠的膀胱已出現(xiàn)逼尿肌損傷、排尿異常,可能仍處于代償期到失代償期的過(guò)渡階段,膀胱功能不穩(wěn)定,膀胱漏尿點(diǎn)壓和最大排尿壓并無(wú)顯著性差異,藥物對(duì)其干預(yù)作用并不顯著。(2)膀胱與腎臟病理學(xué)檢測(cè):膀胱病理學(xué)可見(jiàn),空白組膀胱組織基本正常,模型組大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞增生,固有層水腫,炎細(xì)胞浸潤(rùn),中藥組和西藥組大鼠的膀胱炎癥均減輕,且中藥組效果比西藥組好。腎臟組織病理學(xué)可見(jiàn),中藥對(duì)腎臟有一定的保護(hù)作用,可改善腎臟的炎癥反應(yīng),緩解腎小管擴(kuò)張,在一定程度上緩解糖尿病腎損害,比西藥組改善效果好。3.蛋白芯片檢測(cè):(1)差異蛋白:空白對(duì)照組與模型組之間的差異蛋白有1個(gè),即ICAM-1,空白組與中藥組之間的差異蛋白有6個(gè),即B7-1、Gas 1、IL-2 Ra、IL-22、Nope、Notch-2,與西藥組之間的差異蛋白有7個(gè),即ICAM-1、IL-1b、LIX、TCK-1、TIMP-1、Notch-1、Notch-2,中藥組與模型組之間的差異蛋白有1個(gè),即L-Selectin,西藥組與模型組之間的差異蛋白有3個(gè),即L-Selectin、PDGF-AA、Notch-2,中藥組與西藥組之間的差異蛋白有2個(gè),即PDGF-AA、RANTES。(2)GO富集分析:中藥組與西藥組之間顯著富集的GO term共有414種,與富集的GO term最相關(guān)的5種生物學(xué)功能有:a.對(duì)ERK1/2(細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶)的正調(diào)控作用。b.蛋白激酶B的信號(hào)調(diào)節(jié)。c.肌醇脂質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)通路。d.磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)通路。e.磷脂酰肌醇-3激酶信號(hào)通路。空白組與模型組、中藥組與模型組之間沒(méi)有顯著富集的GO。(3)KEGG富集分析:通過(guò)分析發(fā)現(xiàn),中藥組和西藥組之間最為顯著的是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路。4.Elisa驗(yàn)證:驗(yàn)證結(jié)果與蛋白芯片結(jié)果一致。結(jié)論:加味五苓散可有效改善DNB模型大鼠的膀胱功能,并對(duì)其腎臟有一定的保護(hù)作用,可能通過(guò)對(duì)其炎癥機(jī)制的干預(yù)實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2630370