【摘要】：慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)是多種原因造成的慢性進行性腎實質(zhì)損傷,腎纖維化是整個腎臟損傷過程的主要病理特征和根本病理改變。在CKD的臨床治療上,藥用大黃已凸顯出獨特的作用,但其主要的活性部位及各部位抗腎纖維化的作用機制尚待進一步研究。代謝組學(xué)在疾病的臨床診斷、病理機制探究、生物標(biāo)示物鑒定及藥物作用機制研究中有不可或缺的作用。因此,本研究欲結(jié)合藥理學(xué)及代謝組學(xué)的研究方法,從分子生物學(xué)與生物化學(xué)角度共同闡釋中藥大黃治療CKD的主要活性部位及其抗腎纖維化的作用機制。研究方法:將40只體重為200±10 g的雄性SD大鼠隨機分為對照組(CTL)、CKD組和大黃石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(BU)提取物給藥組。后四組大鼠灌服200 mg/kg·d~(-1)的腺嘌呤(含1%體積的阿拉伯膠),CTL組灌服等體積的生理鹽水。大黃PE、EA和BU提取物組大鼠給予腺嘌呤3 h后再分別灌服劑量為800 mg/kg·d~(-1)的PE提取物、200 mg/kg·d~(-1)的EA提取物和600 mg/kg·d~(-1)的BU提取物。分別于第3和6周末,收集各組大鼠尿液;于第6周末,取頸動脈血和腎組織。血清和尿液用于生化指標(biāo)檢測、代謝組學(xué)與脂質(zhì)組學(xué)研究;腎組織用于代謝組學(xué)、病理學(xué)、免疫組織化學(xué)及蛋白印跡研究。研究結(jié)果:(1)生化指標(biāo)檢測:相比CTL組,CKD組血清中肌酐、尿素、甘油三酯、膽固醇、尿酸等含量顯著增加。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,肌酐、尿素、甘油三酯、膽固醇和白細(xì)胞的含量顯著地減少,肌酐清除率、紅細(xì)胞和血球密度的含量顯著地增加,表明大黃各提取物對腎功能均有顯著的改善作用。(2)病理學(xué)研究:蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)和糖原染色(Periodic acid-schiff stain,PAS)染色結(jié)果顯示CKD組腎組織中腎小管管腔擴張和炎細(xì)胞浸潤增加;Masson染色結(jié)果顯示CKD組大鼠腎組織顯示不同程度的纖維化。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,腎小管管腔擴張和腎間質(zhì)纖維化明顯減輕,炎細(xì)胞浸潤減少。其中,大黃EA提取物給藥組的效果最佳,BU提取物的效果次之。(3)免疫組織化學(xué)分析:相比CTL組,CKD組中α-SMA、Collagen I、Fibronectin和TGF-β/Smad信號通路中p-Smad2,Smad2,p-Smad3,Smad3與Smad4的表達顯著的升高,而Smad7的表達顯著的降低。大黃各提取物顯著抑制這些蛋白的異常表達;其中,大黃EA及BU提取物的抑制效果最佳。(4)蛋白印跡分析:相比CTL組,CKD組中TGF-β1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I、Collagen III、PAI-1、Vimentin、FSP1的表達顯著地增加,E-cadherin的表達顯著地減少。大黃PE、EA和BU提取物給藥后可逆轉(zhuǎn)E-cadherin的下調(diào),顯著降低TGF-β1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I、Collagen III、PAI-1、Vimentin和FSP1的表達。(5)尿液代謝組學(xué)研究結(jié)果:從大鼠尿液中鑒定28個生物標(biāo)示物,代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物與氨基酸、肌酐、嘌呤及嘧啶代謝密切有關(guān)。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,N-乙酰半胱氨酸、(2S)-2-[[9-[(2S,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基]嘌呤-6-基]氨基]丁二酸、肌酐、脫氧腺苷、組胺、羥基丙酮酸和甲基胞嘧啶的含量顯著地增加,色氨酸、甲基N-3-丁烯酰甘氨酸酯、3-甲基二氧基吲哚、吡哆醇、嘧啶和三甲胺的含量顯著地降低。該結(jié)果表明大黃各提取物可顯著地改善異常的氨基酸、肌酐、嘌呤及嘧啶代謝,從而進一步延緩腎纖維化。(6)血清代謝組學(xué)及血漿脂質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果:24個生物標(biāo)示物進行鑒定分析發(fā)現(xiàn)14個生物標(biāo)示物源于血清代謝組學(xué)研究的結(jié)果,10個生物標(biāo)示物源于脂質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果。代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)24個生物標(biāo)示物與脂肪酸、煙酸、嘧啶和花生二烯酸代謝有關(guān)。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,5,6-丙酸乙酯、葡糖腦苷脂、甘油三酯(55:1)、D-葡萄糖和哌啶甲酸的含量顯著地增加;甘油三酯(53:0)、甘油二酯(38:9)、神經(jīng)酰三己糖苷、棕櫚酸、組氨酸-谷氨酰胺和煙酰胺的含量顯著減少,表明大黃各提取物對異常的脂肪酸代謝、煙酸、嘧啶和花生二烯酸代謝有明顯的改善作用。(7)腎組織代謝組學(xué)研究結(jié)果:腎組織代謝組學(xué)研究鑒得21個生物標(biāo)示物,代謝途徑研究發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)示物與氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸、三羧酸循環(huán)和煙酸代謝有關(guān)。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,微球蛋白(18:3)、溶血磷脂酰膽堿(18:1)、硬脂酸、棕櫚酸和亞麻酸的含量顯著地減少,十六烯二酸和犬尿酸的含量顯著地增加。其中,EA提取物給藥組亞�；撬岬暮匡@著地減少。BU提取物給藥組3-羥基丁酸、2-甲基呋喃、尿嘧啶和PE提取物給藥組苯基丙酮酸及煙酰胺的含量顯著地增加,十八碳烯酸和棕櫚酸的含量顯著地減少。該結(jié)果表明大黃各提取物對異常代謝的氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸、三羧酸循環(huán)、煙酸代謝有很強的改善作用。結(jié)論:藥理學(xué)及代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大黃PE、EA和BU提取物是大黃治療CKD的活性部位,三個活性部位均有改善腎功能和抗腎纖維化的作用。其作用機制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路和改善氨基酸、肌酐、嘌呤、嘧啶、脂質(zhì)與煙酸等在內(nèi)的多種異常代謝有關(guān)。
【圖文】：

用于蛋白印跡分析和灰度測定。2.4 實驗結(jié)果2.4.1 大黃治療 CKD 的 HE 染色結(jié)果如圖 5 所示，，CKD 組腎小管管腔擴張、炎細(xì)胞浸潤增加；相比 CKD 組，CKD+PE提取物給藥組腎小管管腔擴張減輕，但炎細(xì)胞浸潤未見減少；CKD+EA 提取物給藥組炎細(xì)胞浸潤顯著減少，腎小管管腔擴張顯著減輕；CKD+BU 提取物給藥組，炎細(xì)胞浸潤減少，腎小管管腔擴張減輕。

圖 6 CTL 組、CKD 組及各給藥組大鼠腎臟組織 Masson 染色分析（ 200）附注 2：**表示 CKD 組與 CTL 組比較 P < 0.01；#表示大黃提取物給藥組與 CKD 組比較 P < 0.05，##表示大黃提取物給藥組與 CKD 組比較 P < 0.01。2.4.3 大黃治療 CKD 的 PAS 染色分析結(jié)果結(jié)果如圖 7 所示，相比 CTL 組，CKD 組腎小管管腔顯著擴張；大黃提取物給藥后，腎小管管腔擴張均減輕。其中，大黃 EA 提取物給藥組腎小管管腔擴張顯著減輕，大黃BU 和 PE 提取物給藥組的效果次之。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2630316