發(fā)布時間：2020-03-29 14:54

【摘要】：背景:艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS,Acquired Immune Deficiency Syndrome),是一種由于感染I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1,Human Immunodeficiency Virus type 1)導致機體免疫功能完全喪失的傳染性疾病。國家衛(wèi)生與計劃生育委員會的數據顯示,2016年我國現存AIDS患者約62萬人,這為公眾健康以及社會穩(wěn)定帶來了巨大的隱患。AIDS的治療一直是世界性的難題。目前臨床上主要使用逆轉錄抑制劑、整合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等,但是當前的治療方法不能完全消滅病毒治愈艾滋病。并且當前的抗病毒治療容易產生耐藥性和嚴重的毒副作用限制了其發(fā)展,因此研制安全有效的HIV-1疫苗是HIV的預防和控制新的方向。HIV-1病毒具有高突變和基因重組多樣的特點,HIV疫苗的研究面臨巨大的困難與挑戰(zhàn)。CCR5(The C-C chemokine receptor type 5)受體是臨床現有HIV-1毒株必不可少的共受體之一,是導致全球HIV-1病毒株傳播的主要共受體,使得它可以作為抗病毒治療的重要靶點。CCR5作為宿主細胞中的固有受體,在HIV感染中發(fā)揮重要作用并且保守性較強,十分適合作為抗HIV-1研究的切入點。本研究中針對CCR5受體主要做了兩方面的工作,一方面通過添加中藥提取物至穩(wěn)定表達CCR5的細胞系中,利用流式細胞術檢測CCR5蛋白在藥物作用下的表達情況,從而判斷體外添加中藥提取物對CCR5受體的作用以及抗HIV-1的活性;另一方面主要采用哺乳動物雙雜交系統(tǒng),研究抗HIV-1中和抗體PRO140與宿主細胞CCR5基因的相互作用,為進一步的作用于CCR5分子抗體的篩選和研究打下基礎。目的:研究體外狀態(tài)下中藥提取物對CCR5蛋白表達的影響,從而判斷該中藥是否具有潛在的抗HIV-1活性;構建含有中和抗體基因的質粒pVP16-PRO140,將重組質粒與含有CCR5的質粒共轉染到CHO細胞中,通過檢測報告基因來分析,兩個蛋白是否有相互作用,為進一步抗體方面的研究打下基礎。方法:1.添加中藥提取物至穩(wěn)定表達CCR5蛋白的細胞系,使用流式細胞術檢測CCR5表達受到中藥提取物的影響情況。2.采用質粒提取、酶切、膠回收的方法獲取目的片段PRO140,并將其插入載體pVP16內,構建重組質粒p VP16-PRO140,通過菌落PCR、酶切電泳分析及測序的方法對重組質粒進行驗證。3.同樣采用分子克隆的方法構建重組質粒pM-CCR5,并應用脂質體轉染CHO細胞。將重組質粒pM-CCR5及空載體pM轉染入CHO細胞中,然后使用Western Blot的方法從蛋白水平檢測CCR5基因的表達。4.通過哺乳動物雙雜交系統(tǒng),共轉染質粒pVP16-PRO140和質粒pM-CCR5以及報告基因到CHO細胞中。5.使用分泌型堿性磷酸酶檢測來鑒定PRO140抗體與CCR5受體之間相互作用效果。結論:1.在體外實驗中,中藥提取物穿心蓮內酯和槲皮素均可以不同程度的抑制CCR5蛋白的表達,而蘆丁、白術等提取物對CCR5蛋白的表達無明顯作用。2.初步構建哺乳動物雙雜交系統(tǒng),并驗證了CCR5蛋白與單鏈抗體PRO140的相互作用,證明該系統(tǒng)可以用于檢測CCR5蛋白與目標蛋白是否有相互作用,進行靶向CCR5受體的抗體藥物的篩選。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2606125