【摘要】：多胺可促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù),還可調(diào)控緊密連接及粘附連接的形成和穩(wěn)定而保護(hù)黏膜屏障功能。胃腸黏膜損傷是脾虛證常見的病理改變,四君子湯是益氣健脾的代表方,臨床常用于改善胃腸病患者脾氣虛證。課題組前期研究表明,四君子湯水提物及黨參、黃芪、甘草、白術(shù)的多糖提取物對(duì)應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜損傷有防治作用,機(jī)制與其提高胃或小腸黏膜多胺含量有關(guān);對(duì)胃腸黏膜損傷修復(fù)環(huán)節(jié)——上皮細(xì)胞遷移的研究發(fā)現(xiàn),黨參、白術(shù)、黃芪、甘草、四君子湯的提取物(多糖、黃酮等)能促進(jìn)小腸上皮IEC-6細(xì)胞遷移,作用與其影響多胺信號(hào)通路有關(guān),Ca~(2+)調(diào)節(jié)是關(guān)鍵指標(biāo);白術(shù)多糖能提高IEC-6細(xì)胞粘附連接蛋白E-cadherin、β-catenin、α-catenin表達(dá);但尚待在整體動(dòng)物水平從細(xì)胞連接方面探討益氣健脾中藥胃腸黏膜損傷修復(fù)作用機(jī)制。研究目的觀察四君子湯(水提物和多糖)對(duì)吲哚美辛造模大鼠胃和小腸黏膜損傷的影響,并從多胺調(diào)節(jié)黏膜屏障和細(xì)胞連接蛋白的角度,探討益氣健脾代表方四君子湯防治胃腸黏膜損傷的作用機(jī)制。研究方法1、四君子湯水提物和多糖的提取分離:四君子湯藥材(人參、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草各等份)經(jīng)水煎煮得四君子湯水提物,HPLC法進(jìn)行成分分析;四君子湯經(jīng)水提醇沉法、sevag法去蛋白,分別得“四君子湯多糖1”、“四君子湯多糖2”并以苯酚硫酸法檢測(cè)糖含量,HPLC法檢測(cè)“四君子湯多糖2”純度。2、吲哚美辛致大鼠胃腸黏膜損傷模型的復(fù)制:大鼠皮下注射吲哚美辛(10mg/kg、40mg/kg)造模,7h后處死,篩選胃黏膜損傷造模的合適劑量;大鼠皮下注射吲哚美辛(4mg/kg、8mg/kg)造模,3d或7d后處死,篩選小腸黏膜損傷造模的合適劑量;以吲哚美辛6mg/kg+四君子湯水提物10g/kg,給藥3d或7d,篩選四君子湯防治小腸黏膜損傷合適的給藥時(shí)間。3、四君子湯防治大鼠胃和小腸黏膜損傷實(shí)驗(yàn):(1)胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn):灌胃四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)1h后,吲哚美辛40mg/kg皮下注射造模,7h后處死動(dòng)物,取材胃黏膜及血漿,記錄各組胃黏膜損傷大體評(píng)分,HE染色進(jìn)行病理評(píng)分;(2)小腸黏膜損傷實(shí)驗(yàn):吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,造模共6d,每天再灌胃四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)或四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg,與水提物生藥量相當(dāng))共6d為給藥方法,第7天處死動(dòng)物,取材小腸黏膜及血漿,記錄小腸黏膜損傷大體評(píng)分,HE染色進(jìn)行病理評(píng)分。4、柱前衍生HPLC法檢測(cè)胃、小腸黏膜多胺含量。5、試劑盒檢測(cè)血漿D-乳酸濃度。6、ELISA法檢測(cè)胃、小腸黏膜Ca~(2+)含量。7、Western blot和免疫組化法檢測(cè)胃黏膜緊密連接蛋白(Occludin、ZO-1、Claudin-3)和粘附連接蛋白(E-cadherin、α-catenin、β-catenin)表達(dá);免疫組化法檢測(cè)小腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-3)和粘附連接蛋白(α-catenin、E-cadherin、β-catenin)表達(dá)。研究結(jié)果1、四君子湯提取物的純化及分析:四君子湯水提物得率35.42%,為本研究受試藥之一;高效液相色譜法可檢測(cè)到甘草苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和白術(shù)內(nèi)酯III等成分;四君子湯多糖1、多糖2得率分別為8.77%、7.16%,多糖含量分別為92.34%、81.59%;根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,多糖2藥效較優(yōu),選為本研究受試藥之一,高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)“四君子湯多糖2”分子量較集中,是純度較高的多糖,但存在其它較小的吸收峰,并非均一性多糖。2、吲哚美辛致大鼠胃和小腸黏膜損傷造模實(shí)驗(yàn)方案:(1)胃黏膜損傷模型:吲哚美辛(40mg/kg)皮下注射7h后,可造成大鼠胃黏膜損傷;吲哚美辛40mg/kg選為胃黏膜損傷造模劑量。(2)小腸黏膜損傷模型:吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,共6d,可造成大鼠小腸黏膜損傷;造模同時(shí)以四君子湯水提物(10g/kg)灌胃給藥對(duì)小腸黏膜損傷有防治作用;吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,共6d(第7天處死),選為大鼠小腸黏膜損傷造模條件。3、四君子湯對(duì)吲哚美辛致大鼠胃和小腸黏膜損傷的影響:(1)四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)對(duì)造模大鼠胃黏膜損傷有防治作用;(2)四君子湯水提物(15g/kg)和多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)對(duì)造模大鼠小腸黏膜損傷有防治作用,大體和病理評(píng)分與模型組比較P0.05或P0.01,同等生藥量下四君子湯多糖藥效優(yōu)于水提物。4、四君子湯對(duì)造模大鼠胃和小腸黏膜多胺含量的影響:(1)四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)可提高造模大鼠胃黏膜多胺(精脒)含量;(2)四君子湯水提物(15g/kg)、四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)可提高造模大鼠小腸黏膜多胺(精脒)含量;提示四君子湯防治胃腸黏膜損傷作用可能與其提高多胺含量有關(guān)。5、四君子湯對(duì)造模大鼠腸通透性指標(biāo)(血漿D-乳酸)的影響:(1)吲哚美辛致胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血漿D-乳酸明顯升高(與正常組比較P0.01),提示吲哚美辛造�？梢鹉c通透性增高,而四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)給藥8h后,對(duì)造模大鼠血漿D-乳酸升高無明顯影響。(2)吲哚美辛致小腸黏膜損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血漿D-乳酸明顯升高(與正常組比較P0.01);四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)給藥6d,可降低小腸黏膜損傷大鼠血漿D-乳酸(與模型組比較P0.05或P0.01),提示四君子湯可改善小腸黏膜損傷所致的腸通透性增高。6、四君子湯對(duì)造模大鼠胃和小腸黏膜Ca~(2+)含量的影響:(1)吲哚美辛致胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠胃黏膜Ca~(2+)含量降低(與正常組比較P0.05),提示胃黏膜損傷可引起Ca~(2+)含量降低;四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)給藥8h后胃黏膜Ca~(2+)含量略高于模型組(P0.05)。(2)吲哚美辛致小腸黏膜損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠小腸黏膜Ca~(2+)含量略低于正常組(P0.05);四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(1.074g/kg)能提高小腸黏膜Ca~(2+)含量(與模型組比較P0.05);提示四君子湯一定程度上可提高造模大鼠小腸黏膜Ca~(2+)含量。7、四君子湯對(duì)造模大鼠胃和小腸黏膜緊密連接和粘附連接蛋白表達(dá)的影響:(1)吲哚美辛致胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)能提高造模大鼠胃黏膜緊密連接ZO-1、Occludin、Claudin-3和粘附連接E-Cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)(與模型組比較P0.05或P0.01),但對(duì)β-catenin表達(dá)無明顯影響;(2)吲哚美辛致小腸黏膜損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)能提高造模大鼠小腸黏膜緊密連接ZO-1、Occludin、Claudin-3和粘附連接E-cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)(與模型組比較P0.05或P0.01);四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(1.074g/kg)對(duì)β-catenin表達(dá)有提高作用(與模型組比較P0.05)。研究結(jié)論四君子湯(水提物和多糖)對(duì)吲哚美辛所致胃和小腸黏膜損傷有防治作用,可提高造模大鼠胃和小腸黏膜多胺(精脒)含量,提高胃和小腸黏膜緊密連接和粘附連接蛋白表達(dá),對(duì)腸通透性指標(biāo)增高和黏膜Ca~(2+)含量降低有改善作用,提示其防治胃腸黏膜損傷的作用可能與影響多胺和黏膜屏障有關(guān);多糖是四君子湯胃腸黏膜保護(hù)的有效組分之一。研究結(jié)果為探討益氣健脾方藥胃腸黏膜保護(hù)作用提供了參考。
【圖文】：

吲哚美辛 40mg/kg 組圖 2-1-1 吲哚美辛不同表 2-1-1 吲哚美辛不同劑正常組 吲哚美辛 10mg/kg 組 吲哚美辛 40mg/kg 組 2.2.1.3.2 吲哚美辛不同劑量對(duì)大鼠小如圖 2-1-2、表 2-1-2 所示，正常組大常；吲哚美辛 10mg/kg 組大鼠小腸腸管未評(píng)分較正常組高；吲哚美辛 40mg/kg 組大損傷，大體評(píng)分與正常組無明顯差異。

吲哚美辛 40mg/kg 組 吲哚美辛 40mg/kg 組圖 2-1-2 吲哚美辛不同劑量對(duì)大鼠小腸黏膜損傷圖表 2-1-2 吲哚美辛不同劑量對(duì)大鼠小腸黏膜損傷的評(píng)分n 評(píng)分正常組 2 0吲哚美辛 10mg/kg 組 5 4.80 1.30吲哚美辛 40mg/kg 組 5 0.40 0.552.2.1.4 討論本節(jié)以吲哚美辛（10mg/kg、40mg/kg）大鼠皮下注射造模，發(fā)現(xiàn)吲哚美辛（40mg/kg）能造成大鼠胃黏膜急性損傷，而對(duì)大鼠小腸未造成明顯損傷，，與本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[38]，胃黏膜損傷模型復(fù)制成功，40mg/kg 選為后續(xù)胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)造模劑量；而吲哚美辛（10mg/kg）皮下注射則使大鼠小腸黏膜出現(xiàn)較明顯損傷，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[39]，較低劑量（如 10mg/kg）吲哚美辛皮下注射可能會(huì)引起大鼠小腸黏膜急性損傷，但本節(jié)實(shí)驗(yàn)大鼠樣本量較少，待后續(xù)進(jìn)一步探討。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2603503