RNA聚合酶Ⅱ在啟動(dòng)子附近的轉(zhuǎn)錄暫停與釋放,是真核生物調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,快速響應(yīng)刺激的一種手段。我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),BRD4參與這個(gè)過(guò)程。JQ1是一種抑制BRD4的小分子抑制劑,目前還未用于臨床。阿霉素(doxorubicin)是一種化療藥物,能夠用于治療多種實(shí)體瘤和血液腫瘤,它的副作用主要是會(huì)產(chǎn)生心肌毒性。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)阿霉素能夠活化BRD4,我們認(rèn)為這是細(xì)胞應(yīng)對(duì)阿霉素?fù)p傷的一種自我保護(hù)機(jī)制。由此我們推測(cè):抑制BRD4的活化會(huì)增加阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本文以JQ1作為抑制BRD4的主要手段,以人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和人黑色素瘤細(xì)胞M14為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡分析、實(shí)時(shí)定量PCR、染色質(zhì)免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù),探究JQ1能否增敏阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的問(wèn)題。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)JQ1能夠增敏阿霉素誘導(dǎo)HCT116等多種實(shí)體瘤細(xì)胞的凋亡,且增敏效果顯著。接著,我們又對(duì)JQ1增敏阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示JQ1增敏阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過(guò)調(diào)控抗凋亡和促凋亡基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,并且這個(gè)過(guò)程依賴于P53。阿霉素通過(guò)活化...

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 RNA聚合酶Ⅱ在啟動(dòng)子附近的暫停與釋放
        1.1.1 RNA聚合酶Ⅱ調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄
        1.1.2 RNA聚合酶Ⅱ在啟動(dòng)子附近暫停的現(xiàn)象
        1.1.3 RNA聚合酶Ⅱ在啟動(dòng)子附近暫停與釋放的機(jī)制
    1.2 BRD4及其小分子抑制劑JQ1
        1.2.1 BET家族蛋白
        1.2.2 BRD4的結(jié)構(gòu)
        1.2.3 BRD4的功能
        1.2.4 BRD4——新的癌癥治療靶標(biāo)
        1.2.5 BRD4的小分子抑制劑JQ1
    1.3 化療藥物阿霉素
        1.3.1 阿霉素的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)理
        1.3.2 阿霉素的心肌毒性
    1.4 細(xì)胞凋亡與P53
        1.4.1 細(xì)胞凋亡
        1.4.2 腫瘤抑制因子P53
        1.4.3 P53參與的細(xì)胞凋亡
    1.5 本課題研究的內(nèi)容和意義
        1.5.1 研究?jī)?nèi)容
        1.5.2 研究意義
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材
    2.2 常用試劑配方
        2.2.1 基因克隆相關(guān)試劑
        2.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
        2.2.3 蛋白免疫印跡試驗(yàn)相關(guān)試劑
        2.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀相關(guān)試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 DH5α和Turbo感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.3.3 質(zhì)粒小量提取
        2.3.4 質(zhì)粒中量提取
        2.3.5 DNA酶切
        2.3.6 瓊脂糖凝膠電泳
        2.3.7 玻璃奶法膠回收DNA片段
        2.3.8 酚氯仿法提取DNA
        2.3.9 DNA連接
        2.3.10 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        2.3.11 特異性pLV-shRNA的構(gòu)建
        2.3.12 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.13 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.3.14 慢病毒包裝感染
        2.3.15 細(xì)胞的藥物處理
        2.3.16 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.3.17 蛋白免疫印跡試驗(yàn)
        2.3.18 RNA提取
        2.3.19 逆轉(zhuǎn)錄PCR
        2.3.20 即時(shí)定量PCR
        2.3.21 Annexin V法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.3.22 染色質(zhì)免疫共沉淀
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 敲低BRD4會(huì)增強(qiáng)DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
    3.2 JQ1可以增敏DOX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
    3.3 JQ1增敏DOX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡依賴于P53
    3.4 JQ1抑制BCL2/-XL表達(dá)&DOX促進(jìn)PUMA表達(dá)
    3.5 JQ1抑制BRD4和P-TEFb在BCL-XL啟動(dòng)子區(qū)的募集
    3.6 討論與展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3780369