為實現降糖多肽Brevinin-2GUb在大腸桿菌中的高效表達,本文將Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧還蛋白、His標簽及腸激酶酶切位點的p ET32a載體中,將重組表達載體p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb轉化至大腸桿菌中誘導表達Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白。通過對表達溫度進行優(yōu)化,結果顯示16℃誘導表達20 h后融合蛋白產量達到36 mg/L;該融合蛋白經腸激酶(EK)特異性切割后成功獲得不帶標簽的Brevinin-2GUb多肽,產量約為2.50 mg/L,純度達90%以上。通過反相高效液相色譜對重組表達的Brevinin-2GUb進行鑒定,結果顯示重組表達的Brevinin-2GUb與人工合成的Brevinin-2GUb的氨基酸序列一致。通過血平板檢測發(fā)現,170μg/m L的重組表達Brevinin-2GUb多肽無溶血效應。此外,重組表達的Brevinin-2GUb多肽在濃度為10μg/m L時對INS-1細胞產生顯著的刺激胰島素分泌作用(為基礎釋放量的120.04%;p<0.01)。研究結果為Brev...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株與質粒
        1.1.2 試劑
        1.1.3 多肽
    1.2 方法
        1.2.1 構建重組質粒p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb
            1.2.1. 1 Brevinin-2GUb基因的擴增
            1.2.1. 2 RF線性擴增反應構建重組質粒p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb
        1.2.2 融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb在大腸桿菌BL21(DE3）中的小量表達及表達溫度優(yōu)化
        1.2.3 融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb在大腸桿菌BL21(DE3）中的大量表達及純化
        1.2.4 融合蛋白的腸激酶酶切及純化
        1.2.5 反相高效液相色譜鑒定重組表達的Brevinin-2GUb
        1.2.6 圓二色光譜測定Brevinin-2GUb的二級結構
        1.2.7 質譜檢測重組表達的Brevinin-2GUb是否形成二硫鍵
        1.2.8 Brevinin-2GUb的溶血活性測定
        1.2.9 Brevinin-2GUb對INS-1細胞的促進胰島素分泌活性鑒定
        1.2.1 0 數據統計分析
2 結果與分析
    2.1 p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb重組質粒的構建
    2.2 融合蛋白的重組表達及純化
    2.3 融合蛋白的腸激酶酶切及純化
    2.4 反相高效液相色譜鑒定重組表達的Brevinin-2GUb
    2.5 圓二色光譜測定Brevinin-2GUb的二級結構
    2.6 質譜檢測重組表達Brevinin-2GUb是否形成二硫鍵
    2.7 Brevinin-2GUb的溶血活性分析
    2.8 Brevinin-2GUb的促胰島素分泌活性鑒定
3 結論



本文編號：3745547