氨肽酶N（Aminopeptidase N, APN）是屬于鋅離子依賴性金屬蛋白酶的一類膜結合型外肽酶,以同源二聚體結構存在于細胞膜。APN廣泛存在于大腦、腎、肝臟、胎盤和子宮等。與正常細胞相比,APN在癌細胞表面高水平表達,對腫瘤細胞的侵襲、轉移和腫瘤新血管的形成起著重要的作用,被稱為腫瘤細胞表面相關抗原CD13。近年來,以APN為靶點的腫瘤治療策略迅速發(fā)展起來,APN抑制劑已經成為抗癌藥物研究的熱點課題。因此,發(fā)展和建立快速、可靠及高通量APN抑制劑篩選方法對于研發(fā)新藥物具有十分重要的現實意義。毛細管電泳（Capillary Electrophoresis, CE）具有樣品消耗量少、分離效率高、分析時間短及自動化程度高等優(yōu)點,被廣泛應用于酶反應的測定中,成為了酶活性及酶抑制劑篩選研究常使用的分析手段。電泳調控微分析法（Electrophoretically Mediated Microanalysis, EMMA）是以毛細管電泳柱進樣端約1.5～2.0 cm部分作為反應的微室,將酶溶液和底物溶液依次進樣到毛細管中,接著施加一段時間小電壓讓酶和底物溶液在毛細管中充分混合并反應,當酶促... 

【文章頁數】：86 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
前言
    1 氨肽酶N與腫瘤的關系
        1.1 降解細胞外基質,促進原發(fā)腫瘤的生長侵襲轉移
        1.2 促進腫瘤細胞新血管生成
    2 氨肽酶N抑制劑
        2.1 APN的天然抑制劑
        2.2 APN的小分子合成類抑制劑
    3 氨肽酶N及其抑制劑的活性測定方法
    4 毛細管電泳法在酶反應動力學研究中的應用
        4.1 毛細管電泳在酶反應測定中的應用模式
        4.2 電泳調控微分析法在酶反應測定中的應用
    5 毛細管電泳法在藥物與細胞膜作用研究中的應用
        5.1 細胞膜與藥物的相互作用
        5.2 細胞膜毛細管電泳法
    6 本課題研究目的及主要內容
第一章 氨肽酶N抑制劑電泳調控微分析篩選方法的研究和應用
    1 儀器與材料
        1.1 儀器
        1.2 材料
        1.3 電泳條件
    2 實驗方法
        2.1 溶液的配制
        2.2 毛細管柱的維護
        2.3 EMMA步驟
        2.4 氨肽酶N活性研究
        2.5 氨肽酶N抑制劑抑制動力學研究及抑制劑的篩選
        2.6 酶標法
    3 結果與討論
        3.1 檢測波長的選擇
        3.2 分離條件的優(yōu)化與選擇
            3.2.1 電泳分離模式的選擇
            3.2.2 分離緩沖液中脫氧膽酸鈉濃度的考察
            3.2.3 分離緩沖溶液HEPES濃度的考察
            3.2.4 分離緩沖溶液pH影響
            3.2.5 電泳溫度的考察
            3.2.6 分離電壓的考察
        3.3 EMMA條件的優(yōu)化
            3.3.1 混合條件的選擇
            3.3.2 酶促反應時間的考察
            3.3.3 底物濃度的考察
        3.4 方法驗證
        3.5 氨肽酶N的K_m和V_(max)的測定
            3.5.1 酶標法測定氨肽酶N的K_m和V_(max)
            3.5.2 EMMA法測定氨肽酶N的K_m和V_(max)
        3.6 陽性抑制劑APN抑制動力學分析
        3.7 抑制劑篩選
            3.7.1 初篩
            3.7.2 復篩
            3.7.3 篩選結果分析
    4 小結
第二章 氨肽酶N細胞膜毛細管電泳法的建立與藥物篩選
    1 儀器與材料
        1.1 儀器
        1.2 材料
        1.3 電泳條件
    2 實驗方法
        2.1 溶液的配制
        2.2 細胞培養(yǎng)
        2.3 細胞膜的制備
            2.3.1 細胞膜的分離提取
            2.3.2 細胞膜破碎方法的考察
            2.3.3 細胞膜表征
        2.4 細胞膜CE法
        2.5 模型的驗證
        2.6 細胞膜APN動力學參數測定
        2.7 精密度考察
        2.8 抑制劑的篩選
    3 結果與討論
        3.1 細胞膜制備
            3.1.1 細胞膜分離提取
            3.1.2 細胞膜的表征
        3.2 篩選模型的驗證
        3.3 測定細胞膜表面氨肽酶N的K_m
        3.4 精密度考察
        3.5 抑制劑篩選
            3.5.1 初篩
            3.5.2 復篩
    4 小結
全文總結
參考文獻
致謝
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【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3733778