發(fā)布時(shí)間：2022-02-15 00:54

　　秀麗線蟲（秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans）是第一個(gè)全基因組測(cè)序的多細(xì)胞生物,其60-80%的基因?yàn)槿祟愅椿?擁有約40%的人類疾病相關(guān)基因。熱休克反應(yīng)與許多疾病相關(guān),如在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。本文以以秀麗線蟲為模型、以海參c DNA文庫(kù)為基礎(chǔ)、以抗熱激能力為主要指標(biāo),在整體動(dòng)物水平上建立從cDNA表達(dá)文庫(kù)篩選活性菌株的高通量篩選方法方法。主要結(jié)果如下:（1）高通量篩選平臺(tái)及篩選條件優(yōu)化。首先以96孔板和384孔板為基礎(chǔ),探索了溶液體積、細(xì)菌濃度、檢測(cè)時(shí)間等篩選條件,同時(shí)檢驗(yàn)了秀麗線蟲對(duì)不同菌株的食物偏好性,然后針對(duì)相應(yīng)條件摸索了熒光拍照和圖片分析條件,最終確定了整個(gè)篩選流程。在此過程中,將自動(dòng)移液工作站、微型模式生物自動(dòng)分選系統(tǒng)和高內(nèi)涵自動(dòng)成像設(shè)備進(jìn)行串聯(lián),有效用于高通量篩選。其中,移液工作站可實(shí)現(xiàn)批量精確加液,微型模式生物自動(dòng)分選系統(tǒng)主要工作為精確分選秀麗線蟲至微孔板,高內(nèi)涵成像系統(tǒng)主要檢測(cè)微孔板內(nèi)秀麗線蟲的熒光強(qiáng)度并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。這些設(shè)備的應(yīng)用和整合減少了重復(fù)性勞動(dòng)和人為失誤,增加了實(shí)驗(yàn)的可靠性,提高了篩選效率。（2）抗熱激菌株高通量篩選方法... 

【文章來源】：廣東藥科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

用于高通量篩選的秀麗線蟲表型

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文13本研究使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的明場(chǎng)和FITC通道對(duì)經(jīng)過熱激脅迫的秀麗線蟲進(jìn)行拍照并使用該系統(tǒng)內(nèi)的數(shù)據(jù)處理軟件分析數(shù)據(jù)。此外，我們也使用該設(shè)備的DAPI通道檢測(cè)秀麗線蟲脂褐素含量。圖1.2高通量?jī)x器示意圖1.4研究意義熱休克反應(yīng)是一種在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用的反應(yīng)，是調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要靶標(biāo)之一[104]。該反應(yīng)通過產(chǎn)生多種熱休克蛋白保護(hù)機(jī)體免受高溫、氧化應(yīng)激、重金屬等脅迫的傷害。傳統(tǒng)的藥物篩選方法篩選范圍窄、準(zhǔn)確度低、指標(biāo)單一，而在整體動(dòng)物水平上篩選則需要大量人力物力。盡管由于小鼠與人類之間的遺傳聯(lián)系緊密，人們也對(duì)使用小鼠進(jìn)行藥物測(cè)試非常感興趣，但此類研究費(fèi)力、昂貴且對(duì)難以生成大量數(shù)據(jù)。秀麗線蟲被證明是在藥物發(fā)現(xiàn)過程初期的藥物和藥物測(cè)試應(yīng)用的高度有利的生物學(xué)模型。盡管秀麗線蟲對(duì)人類的基因組匹配性比實(shí)驗(yàn)室小鼠低，但許多疾病基因是人類和秀麗線蟲所共有的，而秀麗線蟲具有生命周期短、體積小和雌雄同體的優(yōu)勢(shì)，而且培養(yǎng)容易、價(jià)格低，可以用液體培養(yǎng)。本論文結(jié)合高通量?jī)x器，采用以秀麗線蟲為模型的高通量篩選系統(tǒng)，以熱激為脅迫條件，大規(guī)模篩選海參cDNA文庫(kù)，構(gòu)建了篩選表達(dá)抗熱激蛋白的活性菌株的高通量篩選方法。1.5研究思路高通量篩選可以以特定的指標(biāo)快速、高效的篩選化合物庫(kù)，尋找具有成藥潛力的化合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的海參cDNA文庫(kù)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的移液工作站、COPASBiosort和高內(nèi)涵成像設(shè)備三臺(tái)高通量篩選的儀器，以抗熱激能力為指標(biāo)，使用秀麗線蟲整體動(dòng)物模型，我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)cDNA文庫(kù)的篩眩在過程中，利用自動(dòng)移液工作站解決秀麗線蟲培養(yǎng)液、藥物、染料的大批量添加問題，利用COPASBiosort解決秀麗線蟲分選和狀態(tài)、數(shù)量的差異問題，利

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文14像設(shè)備解決大批量拍照和分析問題。首先將含有海參cDNA片段的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，加入誘導(dǎo)劑使該片段表達(dá)出蛋白。將已表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌喂食秀麗線蟲一段時(shí)間后，加入熒光染料，進(jìn)行熱激處理。最后使用高內(nèi)涵成像設(shè)備進(jìn)行成像并分析熒光面積。SYTOXgreen熒光染料只能將死亡的秀麗線蟲染色，因此，熒光面積的大小與秀麗線蟲的死亡時(shí)間相關(guān)，秀麗線蟲死亡時(shí)間越晚，熒光面積便越小，表明秀麗線蟲可能食用含有表達(dá)蛋白的大腸桿菌后對(duì)熱激的抵抗能力增強(qiáng)。表達(dá)這種抗熱激蛋白的菌株正是我們需要篩選出的活性菌株。以下為實(shí)驗(yàn)思路圖：圖1.1高通量篩選技術(shù)流程圖


本文編號(hào)：3625586