O-GlcNAc修飾是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的翻譯后修飾,對(duì)細(xì)胞的許多生理機(jī)制都有重要的調(diào)節(jié)作用,異常的O-GlcNAc修飾與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展及其它人類重大疾病存在著密切關(guān)系。目前常用的O-GlcNAc修飾的檢測(cè)方法是依賴抗體進(jìn)行的免疫組化染色或western-blot檢測(cè),雖然準(zhǔn)確,但步驟繁瑣,不適用于大批樣品的檢測(cè)以及抑制劑的篩選。此外,有人在代謝標(biāo)記法的基礎(chǔ)上引入FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)技術(shù),能夠進(jìn)行O-GlcNAc修飾的成像與檢測(cè),但是此類方法中有的只能進(jìn)行細(xì)胞外檢測(cè),有的需要引入特殊化合物容易引起細(xì)胞毒性,適用性不高。所以需要一種方法,能夠方便準(zhǔn)確地檢測(cè)O-GlcNAc修飾并且還可進(jìn)行相關(guān)抑制劑的高通量篩選。我們以轉(zhuǎn)錄調(diào)控為作用原理,構(gòu)建了一個(gè)熒光報(bào)告分子可以在細(xì)胞保持生理活性的狀態(tài)下進(jìn)行O-GlcNAc修飾水平的檢測(cè)。該報(bào)告分子主要包括三個(gè)組分,一個(gè)是功能上受O-GlcNAc修飾影響的轉(zhuǎn)錄因子NeuroD1,另一個(gè)是胰島素啟動(dòng)子(IP)驅(qū)動(dòng)表達(dá)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)作為報(bào)告基因(IG),其中IP受NeuroD1的調(diào)控,第三個(gè)組分是由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的紅色熒光蛋白(RFP)作為內(nèi)參基因(CR)。報(bào)告基因和內(nèi)參基因之間插入轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和翻譯終止密碼子,使兩者相互獨(dú)立。將NeuroD1通過(guò)P2A(一段自我剪切肽鏈)連在RFP下游,使NeuroD1和RFP共用一個(gè)CMV啟動(dòng)子,但利用P2A將兩個(gè)蛋白彼此分開(kāi),各自發(fā)揮功能。我們驗(yàn)證了熒光報(bào)告分子(IGCRN)的功能,可以準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平下調(diào)的情況,還可以響應(yīng)不同濃度的OGT抑制劑OSMI-1和HBP通路的抑制劑DON。同時(shí),我們還用IGCRN檢測(cè)了OSMI-1和DON的EC50,分別是5.93μM和33.08μM。我們希望可以利用IGCRN穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系,進(jìn)行OGT和HBP通路抑制劑的高通量篩選。
【學(xué)位單位】：南開(kāi)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

O-GlcNAc修飾（Hongiketal,2018）

HBP通路（Yangetal,2015）

第一章 前言初發(fā)現(xiàn)于口蹄疫病毒（FMDV）當(dāng)中，位于小核糖核酸病毒兩種蛋白質(zhì)之間。后來(lái)又在許多不同類型的病毒中發(fā)現(xiàn)了其 2A 序列，包括 P2A（porcine teschovirus-1 2A），T2A（Thosea （equine rhinitis A virus 2A），BmCPV 2A（cytoplasmic polyhe BmIFV 2A（flacherie virus 2A）。2A 具有一段高度保守X)NPGP-，其中 X 代表任意一種氨基酸。其切割位點(diǎn)位于這酸（G）和脯氨酸（P）之間，自我切割后，切割位點(diǎn)的 N 端蛋白質(zhì)相連接，而最后一個(gè)果仁糖殘基則保留在原來(lái)的下游的 2A 殘基可以通過(guò)弗林蛋白酶去除。自我剪切機(jī)制見(jiàn)下圖

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本文編號(hào)：2813430