發(fā)布時(shí)間：2020-08-08 23:28

【摘要】：研究目的:微囊藻毒素是一種危害極大的單環(huán)七肽類化合物,是藍(lán)藻的某些屬類產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,在發(fā)生水華的水體中普遍存在。當(dāng)前日漸嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致水華頻發(fā)以致大量微囊藻毒素產(chǎn)生并被釋放進(jìn)入水體。微囊藻毒素嚴(yán)重影響人類健康。目前很多研究表明,微囊藻毒素與人原發(fā)性肝癌、大腸癌的發(fā)生都有緊密的相關(guān)性。近期又有研究發(fā)現(xiàn)Microcystin-LR(MC-LR)可能是引起糖尿病的環(huán)境致病因素之一。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的MCLR染毒24 h能夠引起人肝細(xì)胞株HL7702及小鼠肝臟組織中胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的改變。由于胰島素信號(hào)通路具有應(yīng)對(duì)胰島素刺激作出快速反應(yīng)的能力并有十分復(fù)雜的反饋機(jī)制,探討胰島素信號(hào)通路信號(hào)蛋白對(duì)微囊藻毒素作用的響應(yīng)時(shí)間效應(yīng)顯得尤為重要。因此本研究的目的是研究在更短的染毒時(shí)間條件下不同濃度MCLR對(duì)肝臟胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響以及作用的特點(diǎn),該研究有助于我們今后對(duì)微囊藻毒素與代謝疾病的關(guān)系更加完整的認(rèn)識(shí)。研究?jī)?nèi)容:(一)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):以人肝細(xì)胞株HL7702為材料,探討不同濃度MCLR在不同染毒時(shí)間(30min、1h、6 h)下對(duì)蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性以及胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子,包括Akt、GSK3α、GSK3β及其下游底物糖原合酶(GS)的影響;(二)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。以ICR雄性小鼠為材料,研究在腹腔注射不同濃度MCLR 1小時(shí)后MCLR在肝、胰組織中的積累,MCLR對(duì)肝、胰腺的病理學(xué)影響,以及對(duì)肝臟PP2A及肝臟胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵分子,包括IRS1、Akt、GSK3α、GSK3β及底物GS的影響,并對(duì)其中一些指標(biāo)同時(shí)采取western blot和免疫組化方法檢測(cè)以互相驗(yàn)證。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較分析來探討短時(shí)間染毒條件下MCLR對(duì)肝臟胰島素信號(hào)通路的影響及通過結(jié)合前期的24 h實(shí)驗(yàn)結(jié)果來進(jìn)一步分析可能的作用模式。研究方法:應(yīng)用免疫印跡技術(shù)、細(xì)胞酶活力檢測(cè)研究不同濃度MCLR(0μM、1 μM、5 μM、10 μM)對(duì)人肝細(xì)胞系HL7702中胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的影響,應(yīng)用免疫印跡技術(shù)、細(xì)胞酶活力檢測(cè)、免疫組化、HE組織染色技術(shù)研究不同濃度MCLR(0 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg、120 μg/kg)對(duì)小鼠肝臟組織中胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的影響。研究結(jié)果:(一)MCLR處理HL7702細(xì)胞30 min、1h、6h后均造成PP2A活性的抑制,抑制率呈現(xiàn)染毒濃度及染毒時(shí)間依賴性。(二)在HL7702細(xì)胞中,MCLR處理細(xì)胞30min、1h、6h均引起Akt的磷酸化上升,影響了GSK3和GS的磷酸化水平。(三)給ICR雄性小鼠腹腔注射不同濃度的MCLR后發(fā)現(xiàn),染毒1 h的小鼠活動(dòng)無明顯異常,染毒2h,高劑量組(120 μg/kg MCLR)小鼠開始出現(xiàn)死亡,染毒5h后最高及次高劑量組(80、120 μg/kg MCLR)的小鼠全部死亡。(四)對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行HE染色觀察發(fā)現(xiàn),高劑量組的小鼠肝臟相比對(duì)照組有明顯的肝細(xì)胞變性(濁腫)以及肝出血,但沒有發(fā)現(xiàn)MCLR對(duì)于胰腺有明顯作用。(五)給ICR雄性小鼠腹腔注射MCLR 1 h后測(cè)定其肝臟PP2A活性,發(fā)現(xiàn)PP2A的酶活性呈現(xiàn)濃度依賴性下降,Akt的Ser473以及Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平均呈現(xiàn)濃度依賴性升高,GSK3α以及GSK3β的磷酸化水平和GS及其磷酸化在MCLR刺激下有升高趨勢(shì),其中AKT的Ser473位點(diǎn)的磷酸化、GSK3β的磷酸化以及GS蛋白水平升高的結(jié)果在免疫組化中得到良好驗(yàn)證。(六)腹腔注射ICR雄性小鼠1h取其肝臟,肝組織內(nèi)IRS1的Ser磷酸化水平顯著升高,IRS1總蛋白水平下降。研究結(jié)論:(一)在短時(shí)間染毒條件下,MCLR抑制人肝細(xì)胞系HL7702中PP2A活性,且酶活性抑制率與染毒時(shí)間和染毒濃度呈正相關(guān)關(guān)系。(二)在短時(shí)間染毒條件下小鼠肝細(xì)胞中Akt磷酸化水平受MCLR作用后變化明顯,表明其極短時(shí)間里就會(huì)受到MCLR的影響,這也為檢測(cè)MCLR對(duì)肝臟胰島素通路的早期影響提供了 一個(gè)敏感指標(biāo)。(三)短時(shí)間染毒,MCLR將通過影響IRS1、Akt、GSK3α、GSK3β、GS的磷酸化水平而對(duì)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路產(chǎn)生干擾。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R99
【圖文】：

基于本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果，本研究選取１邋ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ的ＭＣＬＲ胞染毒濃度，在此濃度下ＭＣＬＲ對(duì)細(xì)胞活力以及細(xì)胞周期沒有產(chǎn)生明顯影響１４６期研究發(fā)現(xiàn)２４邋ｈ染毒ＭＣＬＲ對(duì)胰島素信號(hào)通路的信號(hào)蛋白有影響＃１，本研究染毒時(shí)間３０ｍｉｎ、１邋ｈ和６ｈ，檢測(cè)ＭＣＬＲ對(duì)ＰＰ２Ａ活性、胰島素信號(hào)通路中要信號(hào)蛋白Ａｋｔ、ＧＳＫ３、及底物ＧＳ總蛋白及磷酸化蛋白的影響。逡逑．１邐ＭＣＬＲ對(duì)ＨＬ７７０２細(xì)胞中ＰＰ２Ａ活性影響逡逑如圖４．１．１所示，染毒３０邋ｍｉｎ后ＭＣＬＲ就對(duì)細(xì)胞內(nèi)ＰＰ２Ａ活性有了明顯的作用。在三種染毒時(shí)間中，ＭＣＬＲ均能夠引起ＰＰ２Ａ酶活力的下降，隨著染毒的延長(zhǎng)，ＭＣＬＲ對(duì)ＰＰ２Ａ的抑制率也增加。染毒６邋ｈ時(shí)，ＭＣＬＲ對(duì)ＰＰ２Ａ活性制率與本實(shí)驗(yàn)室之前研究中２４邋ｈ染毒的抑制率相似，半抑制濃度ＩＣ５０約在５逡逑ｌＯｐＭ之間丨４７１。逡逑－

４．１．２ＭＣＬＲ對(duì)ＨＬ７７０２細(xì)胞內(nèi)Ａｋｔ總蛋白水平及其磷酸化的影響。用ＭＣＬＲＨＬ７７０２細(xì)胞如圖所示濃度和時(shí)間后，用免疫印跡法檢測(cè)Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８及ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）水平，對(duì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析后用獨(dú)立樣本ｔ驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，ｐ＜０．０１，邋＊＊＊，ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３。逡逑ｉｇ．邋４．１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｏｎ邋Ａｋｔ，邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８）邋ａｎｄ邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）邋ｉｎ邋ＨＬ７７０２Ｌ７７０２邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎ，邋１邋ｈ邋ａｎｄ邋６邋ｈｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ邋ｂｅｆｏｒｅ邋Ａｋｔ，邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８）邋ａｎｄ邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）邋ｗｅｒｅ邋ｅｘａｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ．邋Ｔｈｅ邋ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｔｏ邋ｏｂｔａｉｎ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｓ邋ｗｅｒｅｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ，邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋ｎ＝３．逡逑．１．３邋ＭＣＬＲ對(duì)ＨＬ７７０２細(xì)胞中ＧＳＫ３的影響逡逑ＧＳＫ３是Ａｋｔ的底物之一，Ａｋｔ磷酸化ＧＳＫ３而抑制其激酶活性ｌ４９］。我們前ＭＣＬＲ染毒２４ｈ實(shí)驗(yàn)中ｐ－ＧＳＫ３ａ、Ｐ－ＧＳＫ３Ｐ都是明顯升高的。本研究中，免跡結(jié)果（圖４．１．３）顯示，不同濃度ＭＣＬＲ處理ＨＬ７７０２邋不同時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)ＧＳＫ３以及0３艮３０總蛋白含量無明顯

圖４．１．３邋ＭＣＬＲ對(duì)ＨＬ７７０２細(xì)胞內(nèi)ＧＳＫ３ｃｔ、ＧＳＫ３Ｐ及它們的磷酸化的影響。所示濃度和時(shí)間ＭＣＬＲ處理ＨＬ７７０２細(xì)胞后，免疫印跡法檢測(cè)ＧＳＫ３ｏｕ邋Ｇｐ－ＧＳＫ３ａ以及Ｐ－ＧＳＫ３Ｐ水平，對(duì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度分析后用獨(dú)ｔ邋檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；ｎ＝３0逡逑Ｆｉｇ．邋４．１．３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｏｎ邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３ｐ，邋ｐ－ＧＳＫ３ａ邋ａｎｄ邋ｐ－ＧＳＫ３ｐ邋ｉｎ邋ＨＨＬ７７０２邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎ，邋１邋ｈ邋ａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３Ｐ，邋ｐ－ＧＳＫ３ａ邋ａｎｄ邋ｐ－ＧＳＫ３ｐ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘａｍｉｎｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ．邋Ｔｈｅ邋ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｔｏ邋ｏｂｔａｉｎ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｗｅｒｅ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ，邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋ｎ＝３．逡逑４．１．４邋ＭＣＬＲ對(duì)ＨＬ７７０２細(xì)胞中ＧＳ的影響逡逑胰島素信號(hào)通路中，ＧＳＫ３可以催化其底物ＧＳ磷酸化而抑制其糖原合性［５（）１。免疫印跡結(jié)果（圖４．１．４）顯示，不同濃度ＭＣＬＲ處理ＨＬ７７０２不同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ＧＳ總蛋白含量均無明顯影響，而ｐ－ＧＳ呈現(xiàn)濃度依賴性升高趨勢(shì)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明在染毒６ｈ之內(nèi)，ＧＳ的活性狀態(tài)基本沒有特別明

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 麻麗華;;微囊藻毒素的檢測(cè)技術(shù)與污染控制技術(shù)的研究進(jìn)展[J];常州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年03期

2 張志紅,鄭力行,屈衛(wèi)東,朱惠剛;淀山湖微囊藻毒素-LR和類毒素-A的分布狀況[J];中國(guó)環(huán)境科學(xué);2003年04期

3 許秋瑾 ,高光 ,陳偉民;微囊藻毒素的研究進(jìn)展[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2002年06期

4 劉飛;王勇為;;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鯽魚中的微囊藻毒素[J];環(huán)境化學(xué);2010年02期

5 鄧琳,張維昊,鄧南圣,宋立榮;微囊藻毒素的提取與分析研究進(jìn)展[J];重慶環(huán)境科學(xué);2003年11期

6 徐立紅,陳加平,張甬元;活體及離體條件下微囊藻毒素對(duì)魚蛋白磷酸酶的抑制作用[J];中國(guó)環(huán)境科學(xué);1998年05期

7 江珊珊;王良超;李洪波;;On-line SPE-UPLC-MSMS快速檢測(cè)水中痕量微囊藻毒素-LR[J];科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新;2018年10期

8 李建中;;Agilent 1260 UHPLC/6460 QQQ用于微囊藻毒素的檢測(cè)[J];環(huán)境化學(xué);2011年03期

9 蔣智華;張志勇;;微囊藻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2007年02期

10 邢宏;一種快速提取、分析微囊藻毒素的方法[J];中國(guó)給水排水;2004年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 黃玉晶;林輝;劉文毅;曾惠;譚瑤;王靈巧;舒為群;;微囊藻毒素環(huán)境外暴露水平和人群內(nèi)暴露水平差異的影響因素研究[A];2017環(huán)境與公共健康學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)環(huán)境醫(yī)學(xué)與健康分會(huì)、中國(guó)毒理學(xué)會(huì)生化與分子毒理專業(yè)委員會(huì)2017年年會(huì)論文集[C];2017年

2 劉英菊;劉偉鵬;甘翠芬;敖日其冷;何祖宇;;基于擴(kuò)增技術(shù)的微囊藻毒素免疫傳感研究[A];第十三屆全國(guó)電分析化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文摘要集[C];2017年

3 丁勤;許鍇;劉剴剡;孫蓉麗;張娟;尹立紅;浦躍樸;;基于文獻(xiàn)計(jì)量法分析微囊藻毒素毒性研究的熱點(diǎn)及趨勢(shì)(1998-2017)[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第七次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第六次中青年學(xué)者科技論壇論文摘要[C];2018年

4 趙曉琴;陳金媛;宋莉莉;辛元元;;碳納米管電化學(xué)生物傳感器用于水體中微囊藻毒素的檢測(cè)[A];第十一屆全國(guó)電分析化學(xué)會(huì)議論文摘要（4）[C];2011年

5 李紅芳;張會(huì)艷;王旗;戴蕊;李成龍;張西亞;王戰(zhàn)輝;;免疫層析法快速檢測(cè)水體中微囊藻毒素-LR的初步研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第十一屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)討論會(huì)與中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

6 邢鳴鸞;徐立紅;;微囊藻毒素和大田軟海綿酸研究工作的回顧[A];第八屆中國(guó)生物毒素學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要[C];2007年

7 方艷芬;楊靜;鄧安平;黃應(yīng)平;;新型可見光催化劑BiOBr降解微囊藻毒素-LR的研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第27屆學(xué)術(shù)年會(huì)第02分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2010年

8 姜

本文編號(hào)：2786257