【摘要】：目的:ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷病理表現(xiàn)與人體肝內(nèi)膽汁淤積病變最為相似,也是研究膽汁淤積性肝病最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,但是關(guān)于ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷的毒性分子機(jī)制報(bào)道確甚少。非諾貝特是過氧化物酶體增殖物活化受體alpha(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)的激動(dòng)劑,也是最常用的貝特類的抗高血脂藥物,近年來發(fā)現(xiàn)非諾貝特可對(duì)抗膽汁淤積性肝病,但是關(guān)于非諾貝特用于治療膽汁淤積性肝損傷并沒有并沒有明確的臨床用藥指導(dǎo),說明仍有重要的毒理學(xué)與藥理學(xué)問題尚未解決。探究非諾貝特對(duì)抗膽汁淤積性肝病的作用與機(jī)制,對(duì)推動(dòng)非諾貝特用于防治膽汁淤積性肝病有重要現(xiàn)實(shí)意義。方法:1、非諾貝特抗膽汁淤積性肝損傷的作用:野生型小鼠隨機(jī)分為8組:陰性對(duì)照組(WTC)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WT-A)、ANIT非諾貝特三個(gè)組(WT-A-F5、25、125)、非諾貝特劑量組(WT-F5、25、125)。非諾貝特和ANIT均溶于玉米溶劑中,灌胃給藥非諾貝特5、25、125mg/kg每天2次,連續(xù)5天,在第4天的時(shí)候單劑量灌胃給予毒性藥ANIT,48后經(jīng)過量CO2麻醉處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。2、Ppara-null小鼠驗(yàn)證PPARα的作用:非諾貝特按照上述實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)揮預(yù)保護(hù)作用的劑量,然后選用Ppara-null型小鼠驗(yàn)證PPARα的作用。Ppara-null型健康雄性小鼠隨機(jī)分為4組:陰性對(duì)照組(KO-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(KO-A)、ANIT非諾貝特組(KO-A-F25)、非諾貝特劑量組(KO-F25)。非諾貝特和ANIT均溶于玉米溶劑中,灌胃給予非諾貝特25mg/kg每天2次,連續(xù)5天,在第4天的時(shí)候單劑量灌胃給予毒性藥ANIT,48后經(jīng)過量CO2麻醉處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。3、PPARα標(biāo)準(zhǔn)激動(dòng)劑WY-14643的驗(yàn)證PPARα的作用:野生型小鼠隨機(jī)分為4組:陰性對(duì)照組(WT-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WT-A)、ANIT/WY-14643(WT-A-WY)、WY-14643組(WT-WY)。WT-A-WY和WY-14643組飼連續(xù)養(yǎng)0.1%的WY-14643飼料5天,在第4天WT-A和WT-A-WY組別單劑量給予ANIT 75mg/kg,48小時(shí)后量CO2麻醉處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。4、JNK炎癥通路抑制劑SP600125的反向驗(yàn)證JNK的作用:野生型小鼠隨機(jī)分為4組:陰性對(duì)照組(WT-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WTA)、ANIT SP600125(WT-A-SP)、SP600125組(WT-SP)。WT-A-SP和SP600125組腹腔注射SP600125 15mg/kg,半小時(shí)后WT-A和WT-A-SP灌胃給予ANIT 75mg/kg,48小時(shí)后量CO2處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。5、非諾貝特高劑量組SP600125反向驗(yàn)證JNK的作用:為驗(yàn)證高劑量組的損傷來自于JNK炎癥通路的不完全抑制,將野生型小鼠隨機(jī)分為4組:陰性對(duì)照組(WT-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WT-A)、ANIT/非諾貝特125mg/kg(WT-A-F125)、ANIT/非諾貝特/SP600125組(WT-A-F-SP)。灌胃給藥非諾貝特125mg/kg每天2次,連續(xù)5天,在第4天的時(shí)候,WT-A-F-SP組腹腔注射SP600125 15mg/kg,半小時(shí)后WT-A和WT-A-F-SP灌胃給予ANIT75mg/kg,48小時(shí)后量CO2處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。結(jié)果:1、生化和組織學(xué)檢查顯示非諾貝特25 mg/kg一天兩次可完全抑制ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積和肝臟損傷;2、這種保護(hù)作用僅發(fā)生在野生型小鼠中,在Ppara-null型小鼠中無上述保護(hù)作用。3、經(jīng)過Q-PCR分析發(fā)現(xiàn):膽酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因多發(fā)生適應(yīng)性的改變而非非諾貝特的直接調(diào)節(jié);但是非諾貝特對(duì)Oapt1具有下調(diào)作用而對(duì)Mrp4具有上調(diào)作用,這對(duì)緩解ANIT引起的膽汁淤積具有緩解作用;蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn):在所有發(fā)生膽汁淤積性肝損傷的組別中JNK炎癥通路處于激活狀態(tài);并且非諾貝特對(duì)NF-κB、STAT3、JNK信號(hào)通路均有抑制作用。4、WY-14643可完全抑制ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積和肝損傷,同時(shí)抑制NF-κB、STAT3和JNK信號(hào)通路。5、JNK抑制劑SP600125能通過抑制JNK炎癥通路強(qiáng)效抑制ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷。結(jié)論:JNK在ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷以及非諾貝特發(fā)揮抗ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷中擔(dān)任著非常重要的角色,總結(jié)為以下幾個(gè)方面:(1)JNK介導(dǎo)了ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷的炎癥反應(yīng)。(2)非諾貝特可發(fā)揮防止ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷。(3)非諾貝特可以通過上調(diào)Mrp4下調(diào)Oatp1緩解膽汁酸的毒性負(fù)荷。(4)非諾貝特發(fā)揮防止ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷主要是通過激活PPARα后抑制JNK炎癥反應(yīng)而完成效果,并且具有劑量依賴性。
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2722461