【摘要】：目的:設(shè)計合成一系列2,4-二芳基嘧啶類布魯頓氏酪氨酸蛋白激酶(BTK)抑制劑,通過初步評價其對慢性B淋巴細(xì)胞白血病的抗腫瘤活性,以篩出活性更好、毒性更低更加優(yōu)良的化合物。方法:本論文的第一部分以BTK抑制劑Spebrutinib為先導(dǎo)化合物,基于分子雜合策略,在其二苯胺基嘧啶骨架的C-2位引入氨基片段,制備一系列新型的2,4-二芳基嘧啶類小分子化合物,共計12個新型化合物;并借助~1HNMR、~(13)CNMR、HRMS、MS對目標(biāo)分子進行結(jié)構(gòu)鑒定。第二部分以Spebrutinib和Ibrutinib作為陽性對照藥,在激酶水平上,通過定量分析酶促反應(yīng)后剩余的ATP含量來測定BTK酪氨酸激酶半數(shù)抑制率(IC_(50));在體外腫瘤細(xì)胞篩選中,采用CCK-8比色法,選取BTK高表達的人源B淋巴瘤細(xì)胞Ramos和Raji,測定了目標(biāo)分子在48 h作用下對腫瘤細(xì)胞的抑制率IC_(50)值;并采用AO/EB雙染法進行染色,考察最優(yōu)的化合物對腫瘤細(xì)胞Ramos的抑制效果;提取正常外周血單個核細(xì)胞(PBMC),檢測最優(yōu)化合物對正常免疫細(xì)胞的毒性作用;以流式細(xì)胞術(shù)考察最優(yōu)化合物對B淋巴瘤細(xì)胞的凋亡作用以及對細(xì)胞周期的作用機制。結(jié)果:第一部分合成純化獲得12個目標(biāo)分子,并且核磁數(shù)據(jù)與目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)特征一致,高分辨質(zhì)譜特征與目標(biāo)分子分子質(zhì)量一致。第二部分化合物初步活性測試結(jié)果顯示,合成的目標(biāo)分子大多具有良好的抗腫瘤活性,其中D12具有較優(yōu)的抑制BTK激酶活性,IC_(50)為0.23nM;同時,化合物D10對Ramos細(xì)胞和Raji細(xì)胞具有很好的活性,IC_(50)分別為10.5μM、19.1μM;AO/EB熒光染色結(jié)果顯示,與空白組相比,給予化合物D10處理后腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯減少,出現(xiàn)凋亡,細(xì)胞核發(fā)生固縮;毒性試驗中,最優(yōu)化合物D10對正常外周血單個核細(xì)胞(PBMC)幾乎沒有毒性作用;流式細(xì)胞術(shù)考察最優(yōu)化合物D10對B淋巴瘤細(xì)胞Ramos的凋亡具有顯著的提高,同時將細(xì)胞周期抑制了在G0/G1階段。結(jié)論:本研究成功合成得到嘧啶類衍生物;抗腫瘤藥理活性初步研究揭示大多數(shù)合成化合物具有較強的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性,部分化合物如D10的抑制BTK激酶活性及抑制腫瘤細(xì)胞活性要優(yōu)于陽性對照化合物Spebrutinib,可以作為候選化合物進行更進一步的開發(fā)。本文的結(jié)構(gòu)修飾表明:對二苯胺基嘧啶骨架左側(cè)氨基側(cè)鏈進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化能有效改善藥物抗腫瘤活性及毒性,為此類分子的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供構(gòu)效關(guān)系理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943;R96
【圖文】：

圖 3 Spebrutinib 與 BTK 作用示意圖(PDB: 3GEN)結(jié)合 Spebrutinib 的合成方法[17]，通過查閱文獻及本實驗室早期實驗基礎(chǔ)計了下面的合成路線：母核NClN ClR1NClN NHNHOR1NH2NHONO2NHONO2NH2a bc1 2 4a-b3R1= Cl, FR2= H, Cl, MeO

圖 11 化合物 D10 作用于 Ramos 細(xì)胞的 AO/EB 染色實驗（10 ×）3.5 流式細(xì)胞儀檢測3.5.1 凋亡分析本實驗中應(yīng)用流式細(xì)胞凋亡法考察最優(yōu)化合物 D10（20 μM、10 μM 和 5 μM）對 Ramos 細(xì)胞處理 48 后對 Ramos 細(xì)胞增殖的影響。從圖 12 可以看出，在 5 μM、10 μM 、20 μM 時凋亡率達到 38.0%, 46.8% 和 83.6%，與空白組呈顯著差異，濃度依賴性升高。且從柱形圖中可以看出 10 μM 時 D10 與對照藥 Spebrutinib 有顯著學(xué)差異，與 Iburtinib 無顯著學(xué)差異，達到了很好的抑制增殖的效果。

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本文編號：2715253