【摘要】：惡性腫瘤是威脅人類健康的嚴重疾病,化學藥物療法在腫瘤的治療方法中占有舉足輕重的地位。羥基喜樹堿(HCPT)是本世紀60-70年代從我國特有的喜樹種子中提取的同類抗腫瘤單體中抗癌活性最強的微量生物堿,抗癌作用相當于喜樹堿的30倍,與常用的抗癌藥物無交叉耐藥,抗瘤譜廣,毒副作用少。但是仍存在許多不足,如其在體液和血液循環(huán)過程中半衰期很短,給藥量大,對正常細胞組織的毒副作用較嚴重,同時缺乏選擇性,水溶性脂溶性均不好,并且分子中的內(nèi)酯環(huán)對光,pH敏感,開環(huán)后藥理活性喪失等。為了解決上述問題,設計和制備基于喜樹堿的聚合物前藥成為當前的研究熱點。聚合物前藥通常是通過具有生物響應性的連接鍵橋接聚合物骨架和具有可反應和可功能化官能團的小分子抗癌藥物。將小分子抗癌藥物通過共價鍵連接到聚合物骨架上,不僅提高了疏水性藥物的水溶性,與物理包埋的藥物相比,化學鍵合極大增強了藥物分子在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性,降低了非特異性的釋藥行為,而且能在特定腫瘤微環(huán)境條件下發(fā)生快速降解實現(xiàn)自由藥物分子的高效釋放,一方面有效降低了藥物分子對正常組織和器官的毒副作用,另一方面實現(xiàn)了藥物分子在病灶部位的高效累積和增強的治療效果。針對傳統(tǒng)聚合物前藥制備和純化步驟復雜繁瑣,藥物鍵合率低,穩(wěn)定性仍有待進一步提高等問題,本學位論文基于抗腫瘤藥物HCPT,構(gòu)建了一系列對腫瘤微環(huán)境具有響應性的聚前藥,深入研究了兩親性聚前藥的自組裝行為和體外抗腫瘤性能。具體研究工作包括以下五個部分:1.在第一章工作中,基于兩端為炔鍵修飾的寡聚乙二醇(PEG)和兩端為疊氮修飾的HCPT,通過一價銅催化的點擊化學便捷制備了具有交替結(jié)構(gòu)單元和精確藥物負載量的兩親性聚前藥,通過主鏈二硫鍵的引入,同時實現(xiàn)了腫瘤細胞內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)誘發(fā)的聚合物主鏈的降解和抗癌藥物的快速釋放。具體選用了分子量為400和1450的PEG(PEG400和PEG1450)合成了不同載藥量的聚前藥(P(HCPT/DTDE/PEG 400),P(HCPT/DTDE/PEG 1450))。P(HCPT/DTDE/PEG400)和P(HCPT/DTDE/PEG 1450)的親水和疏水鏈段的比例分別為1:2和2:1,研究了不同親水和疏水鏈段比例對聚前藥自組裝結(jié)構(gòu)和體外抗癌活性的影響。這兩種聚前藥在水相中能自組裝形成粒徑小于200nm的膠束納米粒子,但P(HCPT/DTDE/PEG 1450)膠束的臨界膠束濃度(CMC)更低,表明具有較長親水鏈段的膠束其熱力學穩(wěn)定性更好。P(HCPT/DTDE/PEG 1450)和P(HCPT/DTDE/PEG400)膠束均具有較高的載藥量,分別為12%和24%。體外藥物釋放結(jié)果表明P(HCPT/DTDE/PEG 1450)膠束相對于P(HCPT/DTDE/PEG 400)膠束具有更快的釋藥行為,同時A549細胞毒性結(jié)果表明P(HCPT/DTDE/PEG 1450)膠束的IC_(50)值更低,熒光成像結(jié)果表明兩種聚前藥膠束均能被A549細胞有效內(nèi)吞,流式細胞定量分析的結(jié)果表明P(HCPT/DTDE/PEG 400)膠束的內(nèi)吞量更高。綜上,本章工作發(fā)展了一種利用點擊化學便捷制備兼具精確藥物負載量和腫瘤細胞內(nèi)高治療效果的聚前藥的方法。2.在第二章工作中,我們進一步發(fā)展了一種比上一章點擊聚合更為簡單高效的合成策略來制備具有弱酸性pH可裂解的聚合物主鏈的聚前藥。利用PEG兩端的羥基和氧乙烯基修飾的HCPT在催化條件下的縮醛反應,一步制備具有交替結(jié)構(gòu)單元的兩親性聚前藥。由于縮醛鍵在腫瘤弱酸性條件下可以發(fā)生水解而斷裂,因此能有效實現(xiàn)聚前藥在病灶部位的有效去穩(wěn)定化。分別選用分子量為400和1450的PEG(PEG400和PEG1450)合成了具有不同載藥量的聚前藥(P(HCPT/Acetal/PEG 400),P(HCPT/Acetal/PEG 1450))。P(HCPT/Acetal/PEG1450)的載藥量為4.5%,能在在水相中自組裝形成粒徑為207.8nm的膠束,體外藥物釋放結(jié)果表明P(HCPT/Acetal/PEG 1450)膠束在模擬細胞內(nèi)弱酸性條件下(pH=5.0)具有較快的釋藥行為,P(HCPT/Acetal/PEG 1450)膠束具有較好的體外抗腫瘤效果,熒光成像和流式分析的結(jié)果表明該聚前藥自組裝膠束能有效被HeLa細胞內(nèi)吞。綜上,本章工作發(fā)展了一種簡單高效的策略來制備能對腫瘤弱酸性環(huán)境敏感的聚前藥。3.協(xié)同治療可以克服單一藥物治療的局限性,例如:有效藥物濃度較低,嚴重的副反應,治療效果較差的缺點。選用合適的藥物進行協(xié)同治療可以有效改善單一藥物的治療效果。在第三章工作中,我們基于水溶性抗癌藥物氟脲脫氧核苷和疏水抗癌藥物HCPT設計了一種藥物自遞送系統(tǒng)。首先我們合成了了一種兩端為炔基的雙頭RAFT鏈轉(zhuǎn)移試劑,再通過點擊反應將鏈轉(zhuǎn)移試劑和疊氮基修飾的前藥偶聯(lián),制備得到了一種大分子前藥鏈轉(zhuǎn)移試劑。然后通過RAFT聚合含F(xiàn)UDR的單體,最終得到了雙藥聚合物前藥P(HCPT/PFUDRM)。在腫瘤細胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽(GSH)的作用下,釋放出HCPT小分子和親水PFUDR鏈段,PFUDR上的FUDR代謝轉(zhuǎn)換為小分子的5-FU,從而提高抗腫瘤效果。這種雙藥聚前藥的載藥量較高,分別為20%(HCPT),27.5%(FUDR)。P(HCPT/PFUDRM)膠束在水相中自組裝為164nm粒徑的膠束,P(HCPT/PFUDRM)膠束具有較好的體外抗腫瘤效果,熒光成像和流式細胞分析的結(jié)果均表明該聚前藥能被HeLa細胞有效內(nèi)吞。綜上,本章工作發(fā)展了一種利用可控聚合技術(shù)來制備具有較高載藥量的雙藥聚前藥自遞送系統(tǒng)的新方法。4.傳統(tǒng)聚合物前藥大多是將小分子藥物接枝于聚合物的主鏈上,但是由于小分子藥物的空間位阻效應,導致了低的藥物鍵合效率或者直接將藥物分子和親水聚合物鏈段偶聯(lián),但是這種前藥分子的穩(wěn)定性通常不好,需要額外表面活性劑的加入來穩(wěn)定納米粒子。在第四章工作中,我們設計合成了一種兩親性前藥單體,對比研究了兩親前藥單體和單體聚合后得到的刷型聚合物前藥在組裝和抗癌活性上的差異。我們具體選用了分子量為350和750的PEG(PEG 350和PEG 750)合成得到了具有不同載藥量的兩親性前藥單體HCPT-PEG 350,HCPT-PEG 750。HCPT-PEG 350,HCPT/PEG 750的親水鏈段和疏水鏈段的比例分別為1:2和1:1,考察親水鏈段和疏水鏈段比例對聚合物前藥結(jié)構(gòu)和性能的影響。隨后通過RAFT聚合制備了刷形聚前藥PHCPT-PEG 750。單體和聚前藥均具有較高的載藥量,均為15.7%。HCPT-PEG 750前藥單體在水相中自組裝為220nm粒徑的膠束,PHCPT-PEG 750聚前藥在水中自組裝為341nm的膠束,體外藥物釋放結(jié)果表明HCPT-PEG 750前藥膠束相對于PHCPT-PEG 750聚前藥膠束具有更快的釋藥行為,同時細胞毒性結(jié)果表明HCPT-PEG 750聚前藥膠束具有更低的IC_(50)值,熒光成像結(jié)果表明兩種聚前藥均能被HeLa細胞內(nèi)吞,通過流式細胞定量分析了細胞內(nèi)吞行為,結(jié)果表明HCPT-PEG 750聚前藥膠束對HeLa細胞的內(nèi)吞量更高。綜上,本章工作表明HCPT-PEG 750前藥膠束具有較小的粒徑,較快的釋藥行為以及優(yōu)異的抗腫瘤效果。5.雖然將各種動態(tài)刺激響應性化學鍵引入納米載體能增強載體在體內(nèi)循環(huán)過程中的穩(wěn)定性和抗腫瘤治療效果。但仍然存在著由于較低的載藥量和載體穩(wěn)定性不夠?qū)е碌乃幬镄孤┖洼^低的治療效果。為了進一步解決上述問題,得到具有優(yōu)異的載藥量,更好的穩(wěn)定性和治療效果的聚前藥膠束,在第五章工作中,我們基于含電子受體(CPT前藥)和含電子供體的交聯(lián)劑(1,6-已二胺)之間的配位作用,制備了交聯(lián)可生物降解的聚前藥囊泡。我們首先合成了前藥單體(CPTM)、交聯(lián)單體(BEMA)和大分子鏈轉(zhuǎn)移試劑mPEG-RAFT,通過RAFT聚合前藥單體和交聯(lián)單體合成得到了PEG-b-P(CPTM-co-BEMA),通過在該聚前藥自組裝囊泡溶液中,加入1,6-已二胺將囊泡通過配位作用交聯(lián),制備得到了具有交聯(lián)疏水壁的聚前藥囊泡(CP1V)。這種聚前藥囊泡的載藥量較高為34.8%,具有較好的穩(wěn)定性。P1和CP1V囊泡在水相中粒徑分別為230和198nm體外藥物釋放結(jié)果表明交聯(lián)囊泡CP1V的表現(xiàn)優(yōu)于未交聯(lián)囊泡P1,即,在10mM的GSH條件下具有更快的釋藥行為,同時在HeLa和A549中的細胞毒性結(jié)果表明交聯(lián)囊泡CP1V的IC_(50)值更低,熒光成像和流式細胞實驗結(jié)果表明這種交聯(lián)聚前藥囊泡能更快被HeLa細胞內(nèi)吞,具有更高的細胞內(nèi)吞量。綜上,本章工作利用含電子受體的CPT前藥和含有電子供體的1,6-已二胺之間的配位作用,制備了具有還原敏感性的交聯(lián)聚前藥囊泡,為實現(xiàn)兼具高穩(wěn)定性和高治療效果的載體材料提供了新思路。
【圖文】：

統(tǒng)在腫瘤部位廣泛擴張。由于擴張速度太快，管脈系統(tǒng)的形成并不完全，這就導致了腫瘤部位的不規(guī)則、膨脹、曲折的血管生成[32]。腫瘤細胞具有的從非血管生成表型轉(zhuǎn)型到血管生成表型的血管調(diào)控平衡能力對于癌癥惡化起著至關(guān)重要的作用，導致腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，會擴散至全身[33]。1.2.2 增強滲透和滯留效應血管病理生理學的結(jié)構(gòu)變化為納米載藥系統(tǒng)的長循環(huán)系統(tǒng)提供了可能的機遇。與正常部位所不同的是，腫瘤部位的血管表現(xiàn)出了很大的異常情況，比如，大量的內(nèi)皮增生細胞，周皮細胞以及缺陷的基底膜，這些現(xiàn)象增強了血管的滲透作用[34]。內(nèi)皮空隙的范圍是 10-1000nm3，當納米粒子的尺寸在 20-200nm3時，納米粒子可以從脈管孔隙中漏出，并在腫瘤部位處發(fā)生聚集并滲透到腫瘤內(nèi)部。而且，腫瘤部位的淋巴管未分化或者量較少，導致進入腫瘤部位的納米粒子不能被淋巴管有效排出。這種被動的靶向系統(tǒng)首次被 Matsumura and Maeda 提出，也被稱為 EPR 效應[35,36]，如圖 1-1 所示。腫瘤部位異于正常血管的結(jié)構(gòu)特征對于EPR 效應來說至關(guān)重要，，可以使藥物載體有效的運輸?shù)侥[瘤部位從而治療癌癥。

究生學位論文 基于羥基喜樹堿的腫瘤微環(huán)境敏感性聚前藥的設計，合成及其體外抗腫瘤性能研梯度，同時存在于病灶部位和腫瘤部位。這種差異潛在影響了藥物在較低的弱酸性細胞外條件下，暴露的納米載體部分發(fā)生弱酸化物可以更快地通過自由擴散穿透細胞膜。這種相對基本的細胞內(nèi)劃分子的離子化。調(diào)節(jié)這個過程可能對多藥耐藥性有一定的改善。暴下的腫瘤細胞會產(chǎn)生酸性的細胞器，這些細胞器可以誘捕藥物分子的治療活性，如果這些細胞器參與了分泌的過程，那么這些藥物外分泌排出細胞，失去治療效果。pH 響應性載藥納米粒子在腫瘤下的細胞內(nèi)藥物輸送（圖 1-2）。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96

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本文編號：2704016