【摘要】：醋氨酚(又稱對乙酰氨基酚,acetaminophen,APAP)是一種解熱鎮(zhèn)痛藥,存在于市面上多種復(fù)方感冒制劑中,過量使用時,會產(chǎn)生嚴重急性肝臟毒性,導(dǎo)致肝細胞壞死、肝衰竭甚至造成死亡。APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型是研究藥物性肝損傷的經(jīng)典模型。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶家族的一個成員,在細胞受到環(huán)境或細胞因子刺激時會被激活,并參與調(diào)控細胞炎癥、凋亡、生長、分化等過程。過量醋氨酚導(dǎo)致的藥物性肝損傷中存在氧化應(yīng)激,其可能與JNK的激活相關(guān)。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)是Ⅱ相代謝解毒酶之一,催化醋氨酚的有毒代謝產(chǎn)物N-乙酰對苯亞胺醌與谷胱甘肽結(jié)合,提高機體抗氧化水平和解毒功能。本研究在APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的基礎(chǔ)上,通過給予JNK選擇性抑制劑SP600125,確定JNK信號通路和GSTA1在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中的作用,為進一步研究藥物性肝損傷機制奠定基礎(chǔ)。本試驗采用不同劑量APAP給予小鼠,通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性,確定可造成不同程度肝損傷的APAP劑量。在此模型基礎(chǔ)上通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶活性篩選JNK抑制劑SP600125的最適作用劑量。隨后進行JNK信號通路和GSTA1在肝損傷中的作用研究。試驗分為五組:對照組、低劑量APAP組(150 mg·kg~(-1) APAP)、高劑量APAP組(175mg·kg~(-1)APAP)、低劑量APAP+SP組(150 mg·kg~(-1) APAP+2 mg·kg~(-1) SP600125)、高劑量APAP+SP組(175 mg·kg~(-1) APAP+2 mg·kg~(-1) SP600125),應(yīng)用試劑盒檢測血清ALT、AST和肝組織指標(biāo)(MDA、SOD、GSH、GSH-Px)水平;應(yīng)用ELISA試劑盒檢測小鼠血清及肝組織中GSTA1的含量;應(yīng)用HE染色法對肝臟進行病理組織學(xué)檢查;采用Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡;采用Western blot方法測定肝組織中p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos、p-ASK1、ASK1、p-MKK4、MKK4及GSTA1蛋白的相對表達量。通過以上研究,明確在APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中JNK信號通路是否被激活以及JNK、GSTA1與藥物性肝損傷之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明:(1)應(yīng)用梯度劑量APAP給予小鼠灌胃12 h可對其造成不同程度的肝損傷。當(dāng)給藥劑量為150 mg·kg~(-1)時,血清轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高(p0.05);當(dāng)給藥劑量為175 mg·kg~(-1)時,血清轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著升高(p0.01)。最終確定以150 mg·kg~(-1)、175 mg·kg~(-1)作為可以造成不同程度肝損傷的醋氨酚劑量。(2)在肝損傷模型的基礎(chǔ)上,篩選出JNK抑制劑SP600125的最適作用劑量為2 mg·kg~(-1)。(3)JNK抑制劑作用小鼠后,與高劑量APAP組相比,高劑量APAP+SP組血清轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著下降(p0.01),肝組織中丙二醛含量顯著降低(p0.05),超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過氧化物酶活性極顯著升高(p0.01),血清和肝臟中GSTA1含量極顯著變化(p0.01);與低劑量APAP組相比,低劑量APAP+SP組肝組織中丙二醛含量顯著降低(p0.05),超氧化物歧化酶活性顯著升高(p0.05),谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過氧化物酶活性極顯著升高(p0.01),血清和肝臟中GSTA1含量極顯著變化(p0.01)。病理組織學(xué)檢查顯示低劑量APAP組有少量出血點,肝索輕微紊亂,高劑量APAP組肝細胞索消失,大量炎性細胞浸潤,淤血嚴重,細胞碎裂;低劑量APAP+SP組出血點明顯減少;高劑量APAP+SP組無出血點,炎性細胞數(shù)量驟減,肝索排列規(guī)則。Hoechst 33258檢測凋亡結(jié)果表明,APAP組隨著劑量的增加,細胞發(fā)生凋亡的趨勢越明顯,細胞核固縮;給予JNK抑制劑后,細胞凋亡現(xiàn)象明顯減少。以上結(jié)果表明JNK抑制劑減輕了APAP誘導(dǎo)的肝組織損傷和肝細胞凋亡。(4)JNK信號通路上下游蛋白的表達結(jié)果表明,不同劑量APAP組中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos、p-MKK4/MKK4、p-ASK1/ASK1比值均高于對照組,差異極顯著(p0.01);高劑量APAP+SP組p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-MKK4/MKK4、p-ASK1/ASK1比值低于高劑量APAP組;JNK抑制劑沒有降低p-c-Fos/c-Fos比值。說明在小鼠不同程度肝損傷中,JNK信號通路被激活,JNK上下游蛋白磷酸化水平增加;給予JNK抑制劑后,JNK、c-Jun、ASK1、MKK4磷酸化水平下降,但c-Fos磷酸化水平?jīng)]有變化。表明JNK信號通路的激活和JNK上下游蛋白的磷酸化參與了APAP所致的肝損傷,與肝損傷程度呈正相關(guān)。(5)GSTA1蛋白表達的結(jié)果顯示,不同劑量APAP組中GSTA1相對表達量極顯著低于對照組(p0.01);低劑量APAP+SP組GSTA1相對表達量顯著高于低劑量APAP組(p0.05);高劑量APAP+SP組GSTA1相對表達量極顯著高于高劑量APAP組(p0.01)。說明APAP誘導(dǎo)的肝損傷中GSTA1表達量減少,給予JNK抑制劑后表達量增多,表明肝損傷發(fā)生時肝臟GSTA1的表達量降低,肝臟抵抗損傷的能力下降,JNK抑制劑通過抑制JNK的激活保護肝臟,GSTA1表達量上升,肝臟抵抗損傷的能力增強。本研究成功復(fù)制APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型,確定SP600125的最適作用劑量,在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷中,JNK信號通路被激活,應(yīng)用JNK抑制劑可以降低JNK信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化,增加肝臟中GSTA1的表達量,減輕APAP引起的肝損傷和凋亡。明確JNK信號通路在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中的作用,該通路可能通過調(diào)控GSTA1的表達來抵抗過氧化損傷,但其機制仍需進一步深入研究。
【圖文】：

圖 1-1 MAPK 信號傳導(dǎo)途徑[57]Fig. 1-1 MAKP signaling transduction pathways JNK 信號通路相關(guān)研究NK 在細胞受到環(huán)境或細胞因子刺激（包括滲透性休克、發(fā)熱、缺氧、DNA 損傷度重金屬）時會被活化[58, 59]。研究表明，大部分生物過程（如細胞分化、凋亡都與 JNK 激活相關(guān)，因此 JNK 被看做是生理狀態(tài)與病理狀態(tài)的臨界點[60]。起初線菌酮處理的大鼠肝臟中分離出來的 54 kDa MAPK 蛋白[61]，JNK1 和 JNK2 在織器官均有表達，而 JNK3 僅選擇性的存在于大腦、心臟和睪丸中[62]。這三個達 10 個亞型，包括 4 個 JNK1 亞型、4 個 JNK2 亞型和 2 個 JNK3 亞型[63]�；瘧�(yīng)激可以導(dǎo)致 MAP3K 的激活，其中凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 1（ASK1）參與了 JNK1位于 JNK信號通路的上游，通過激活 MKK-4/7激活 JNK。MKK4（MAP kinase MKK7（MAP kinase kinases 4）可以通過在 Thr183 和 Tyr185 的雙重磷酸化對 。在 JNK 信號級聯(lián)中，ASK1 可以激活 MAP2K（如 MKK4 和 MKK7），它們可游激酶 JNK。實驗證明，ASK1 過表達誘導(dǎo)凋亡而 ASK1 沉默表達抑制凋亡[64] 在應(yīng)激或細胞因子導(dǎo)致的凋亡中起調(diào)節(jié)作用。正常生理狀態(tài)下，ASK1 與硫氧還復(fù)合物，但是在病理狀態(tài)時，，在炎癥因子或氧化應(yīng)激存在的條件下，該復(fù)合物會

與分析酚誘導(dǎo)小鼠急性藥物性肝損傷模型的復(fù)制P 誘導(dǎo)小鼠急性藥物性肝損傷模型復(fù)制的試驗中，各劑量組小鼠血化如圖 3-1 和圖 3-2 所示。結(jié)果顯示，與對照組相比，150 mg·kg-1均顯著升高（p<0.05），175 mg·kg-1和 200 mg·kg-1APAP 組 ALT 和（p<0.01）。因此選擇 150 mg·kg-1和 175 mg·kg-1這兩個劑量用于后續(xù)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R965

【參考文獻】

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本文編號：2650549