【摘要】：目的高效表達嗜熱脂肪芽胞桿菌色氨酰-tRNA合成酶(BsTrpRS),獲得創(chuàng)新霉素與BsTrpRS的復合物晶體,并利用X-ray進行晶體衍射數(shù)據(jù)收集和晶體結構程序解析復合物的晶體結構,結合分子動力學模擬從分子水平揭示藥物與受體相互作用的機制,為藥物的設計與優(yōu)化提供理論基礎。方法1.構建含有BsTrpRS蛋白目的基因的表達載體,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得TrpRS蛋白的可溶性表達。2.采用親和層析色譜、離子交換色譜和分子排阻色譜純化目的蛋白,以期獲得純度在90%以上的BsTrpRS,后通過表面等離子共振法(SPR)和等溫滴定量熱法(ITC)來檢測BsTrpRS的活性。3.選用氣相擴散懸滴法,通過優(yōu)化結晶條件(包括蛋白濃度、沉淀劑濃度、溫度和pH等)獲得可進行X-ray衍射的高質量晶體,獲取衍射數(shù)據(jù)。4.采用共結晶法獲取BsTrpRS與創(chuàng)新霉素復合物的晶體。5.將得到的復合物晶體進行X-ray衍射并收集數(shù)據(jù),解析復合物晶體結構,并結合分子動力學模擬和定點突變驗證,揭示創(chuàng)新霉素在BsTrpRS靶點的作用機制。結果1.運用分子生物學方法成功構建含BsTrpRS基因的重組質粒,并通過優(yōu)化得到BsTrpRS蛋白高表達菌株BL21(DE3)。2.運用親和層析、離子交換色譜和分子排阻色譜等蛋白純化下游技術,獲得高純度BsTrpRS蛋白。3.通過SPR和ITC技術,驗證了BsTrpRS的活性,并確證了創(chuàng)新霉素與BsTrpRS之間具有高親和力。4.通過晶體篩選,獲得了X-ray衍射分辨率為2.06?的創(chuàng)新霉素*BsTrpRS二元復合物晶體和2.16?的創(chuàng)新霉素*ATP*BsTrpRS三元復合物晶體,并解析得到各自的復合物三維結構,結合分子動力學模擬和定點突變驗證,從分子水平揭示了創(chuàng)新霉素與BsTrpRS之間的相互作用機制。結論本研究從分子水平闡明了創(chuàng)新霉素與其靶點BsTrpRS相互作用的機制,為創(chuàng)新霉素與BsTrpRS的結合提供了確切的分子結構模型,為后期篩選、設計藥效更好的創(chuàng)新霉素藥物打下理論基礎。圖34幅;表13個;參111篇。
【圖文】：

華北理工大學碩士學位論文大小選擇所需濃度的瓊脂糖凝膠（如 0.9%，稱取TAE），置于微波爐中加熱使瓊脂糖完全溶解。搖勻后，倒入合適的模具中，檢查有無氣泡，插上完全凝固，拔出梳子，將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中液，浸過膠表面。 與上樣緩沖液混合，用移液槍將樣品加入樣品孔，。選擇合適的電壓，接通電源。待指示劑遷移至合凝膠在凝膠成像儀上觀察電泳結果，，并拍照保存。RS 重組質粒構建sTrpRS 與質粒載體 pET-21a(+)分別用 Nde I 和 Xh組質粒 pET-21a-BsTrpRS，如圖 1 所示。

配制： 5×Coomassie 濃縮液稀釋為 1×染液，后用普通濾紙將沉淀，4℃保存。蛋白梯度：mg mL-1的 BSA 標準蛋白溶液與 5 μL 稀釋液（Tri-HCl/PBL 2 mg mL-1的 BSA 標準蛋白溶液，取 5 μL 依次倍比稀白溶液 4 mg mL-1、2 mg mL-1、1 mg mL-1、0.5 mg mLg mL-1、0.0625 mg mL-1、0.03125 mg mL-1、0.015625 mg 標準曲線：到低依次取 3 μL BSA 標準蛋白溶液分別與 300 μL 上述在 OD450 和 OD595 處讀取吸光度值。以 BSA 標準蛋95/OD450 為縱坐標 Y，利用 Excel 軟件制作蛋白標準
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R91

【參考文獻】

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1 肖永紅;;國家細菌耐藥控制行動計劃:基于大健康理念的耐藥控制宏圖[J];中華臨床感染病雜志;2016年04期

2 劉四化;王倩倩;肖良;張黎明;;蛋白質結晶方法的研究進展[J];中國生化藥物雜志;2011年05期

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本文編號：2650106