【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,導(dǎo)致關(guān)節(jié)和周圍組織的慢性進行性炎癥性疾病,最終導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)破壞。急性期促炎細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在RA中呈現(xiàn)出較高水平的表達和多效的生物學(xué)效應(yīng),并促進RA的發(fā)生與進展。關(guān)節(jié)滑液酸化是RA的一個重要病理特征,且酸化程度與關(guān)節(jié)的破壞成正相關(guān)。大量研究報道胞外酸化處理可以顯著地誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡。酸敏感離子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)是細胞外H+激活的陽離子通道家族,可被細胞外酸化微環(huán)境激活,并在酸誘導(dǎo)的細胞損傷中起關(guān)鍵作用。我們課題組前期研究表明酸敏感離子通道1a(Acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)在佐劑型關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis,AA)模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨中高表達且參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨損傷,阻斷ASIC1a對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的保護作用與抑制軟骨細胞的凋亡有關(guān)。近年來研究證實ASIC1a在酸誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。然而,RA關(guān)節(jié)滑液中大量表達的促炎因子(IL-1β和TNF-α)對ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的作用及其機制至今尚不清楚。為此,我們將采用體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞和體內(nèi)AA大鼠模型為實驗對象,開展下述研究:1.IL-1β和TNF-α對ASIC1a的表達與活性的影響采用免疫熒光雙染、Western Blot、實時定量PCR法觀察胞外不同濃度和不同時間IL-1β和TNF-α刺激大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞后對ASIC1a的表達影響。采用Fura-3/AM探針與激光共聚焦顯微鏡檢測細胞Ca2+濃度的方法,分析IL-1β和TNF-α對胞外酸化激活的鈣離子跨膜流動的影響。通過構(gòu)建p GL3-ASIC1promoter熒光素酶報告基因質(zhì)粒,雙熒光素酶報告基因(Dual Luciferase)檢測促炎因子對ASIC1啟動子活性的影響。結(jié)果顯示,IL-1β和TNF-α可以以濃度依賴性方式上調(diào)ASIC1a蛋白與m RNA在關(guān)節(jié)軟骨細胞中的表達,同時也能增加酸誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)水平上升。另外,IL-1β和TNF-α預(yù)處理后可以顯著地增加ASIC1啟動子的活性。結(jié)果提示AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中ASIC1a高表達與IL-1β和TNF-α有關(guān)。2.IL-1β和TNF-α調(diào)控ASIC1a表達和活性的具體分子機制采用免疫熒光雙染觀察AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ASIC1a與促炎因子下游重要的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的共定位情況。通過阻斷NF-κB和MAPK信號通路相關(guān)亞族ERK、p38、JNK、NF-κB p65的磷酸化,來分析NF-κB和MAPK信號通路抑制后對IL-1β和TNF-α上調(diào)ASIC1a表達和啟動子活性的影響。結(jié)果顯示ASIC1a與NF-κB p65在AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中呈明顯的高表達和共定位的現(xiàn)象;IL-1β和TNF-α可以激活NF-κB和MAPK信號通路,且抑制通路激活后可以減弱IL-1β和TNF-α上調(diào)的ASIC1a表達和啟動子活性。進一步采用EMSA和CHIP實驗,來驗證轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65與ASIC1的啟動子中的NF-κB位點結(jié)合的情況。結(jié)果顯示IL-1β和TNF-α均能誘導(dǎo)軟骨細胞NF-κB p65招募到ASIC1基因啟動子區(qū)域,而PDTC(10μM)預(yù)處理1 h能顯著地減弱這種結(jié)合作用。結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通過與ASIC1啟動子序列中NF-κB位點的結(jié)合參與了IL-1β和TNF-α上調(diào)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASIC1a表達的過程。3.IL-1β和TNF-α對ASIC1a介導(dǎo)的大鼠軟骨細胞凋亡的影響采用MTT、LDH、Hoechst 33258染色和流式細胞術(shù)分析促炎因子、鈣離子螯合劑BAPTA-AM、ASIC1a特異性阻斷劑psalmotoxin-1(Pc TX-1)以及ASIC1a的短發(fā)夾RNA(sh RNA)對ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞毒性和凋亡的影響;JC-1檢測線粒體膜電位和Western Blot檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果顯示IL-1β和TNF-α能進一步降低酸抑制的軟骨細胞活力,且增加酸誘導(dǎo)的軟骨細胞LDH的釋放、線粒體膜電位喪失;同時上調(diào)cleaved PARP和cleaved Caspase-3/9的表達以及細胞凋亡率。而這種增強作用可以被ASIC1a特異性抑制劑Pc TX-1、ASIC1ash RNA或BAPTA-AM減弱。結(jié)果提示IL-1β和TNF-α能夠增強ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡。4.ASIC1a激活對IL-1β和TNF-α促進的軟骨細胞基質(zhì)代謝基因表達的影響采用實時定量PCR(q PCR)檢查酸化激活的ASIC1a對IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果顯示IL-1β和TNF-α能顯著地誘導(dǎo)軟骨細胞中MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5 m RNA的表達;而酸化處理(pH 6.0)可以進一步增強促炎因子誘導(dǎo)的MMP-3/13和ADAMTS-5的表達。Pc TX-1預(yù)處理可部分地減少酸增強IL-1β誘導(dǎo)的MMP-3/13和ADAMTS-5 m RNA水平。結(jié)果提示,酸激活的ASIC1a增強了IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞MMP-3/13和ADAMTS-5的表達。綜上所述,本研究結(jié)果提示IL-1β和TNF-α能以NF-κB依賴性方式促進ASIC1a的表達和活性,進而增強ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡;這也豐富人們對ASIC1a和促炎因子功能的認(rèn)識,為RA的防治提供新思路。
【圖文】：

SF）中表現(xiàn)出一定程度的酸化，并且活動期 RA 患者6.0以下[15-18]。值得注意的是，放射學(xué)結(jié)果顯示出 RA患節(jié)的破壞成正相關(guān)[16, 19]。近期已有研究報道，關(guān)節(jié)軟影響，這些結(jié)果都提示酸化可能參與了 RA 的軟骨損研究也發(fā)現(xiàn)，胞外酸化可以 pH 依賴性的誘導(dǎo) AA 大鼠節(jié)軟骨細胞基質(zhì)成分Ⅱ型膠原和蛋白多糖聚糖體的降酸化參與了 RA關(guān)節(jié)軟骨的破壞[20-23]。細胞凋亡-sensing ion channels, ASICs）是屬于上皮鈉通道（Na+（degenerin, DEG）家族的電壓非依賴性陽離子通道，所激活[24]。迄今為止，在哺乳動物中已經(jīng)鑒定了由 4CN2，ACCN3 和 ACCN4）編碼的 7 個 ASIC 蛋白質(zhì)亞1b2, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3, ASIC4）[25]。這些 ASICs體

結(jié)果.1 ASIC1a 和 NF-κB p65 在 AA 大鼠關(guān)節(jié)軟骨中高表達與共定位情況.1.1 AA 模型的建立及其病理學(xué)變化情況.1.1.1 CFA 誘導(dǎo)的 AA 大鼠模型大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）是多關(guān)節(jié)炎的實驗?zāi)Ｐ停驯粡V泛用于疾病發(fā)病研究和許多抗關(guān)節(jié)炎藥物的臨床前研究[39]。SD 大鼠足爪免疫后第 28 天，，誘重的關(guān)節(jié)炎。結(jié)果顯示：造模后第 21 天后，與正常組大鼠比較，AA 模型組繼發(fā)測足爪有明顯地腫脹、明顯僵直和畸形，尾部出現(xiàn) “關(guān)節(jié)炎”結(jié)節(jié)（A）；與正常組相比，AA 組大鼠體重增長有顯著地抑制現(xiàn)象（圖 1B）；與正大鼠比較，AA模型組的關(guān)節(jié)炎評分（AA score）隨著造模時間增加（d14, d228），關(guān)節(jié)炎評分越高（圖 1C），表明 AA 動物模型造模成功。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R965

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本文編號：2645741