【摘要】：水稻是高度自花授粉的作物,由于它不含有任何有害成分,因此是美國聯(lián)邦食品藥品管理局(FDA)公認的安全(General recognized as safe,GRAS)植物。已經(jīng)證明水稻胚乳作為生物反應器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白閂具有成本低、提取純化工藝簡單、規(guī)�；菀�、安全性好等優(yōu)勢,因此它可以成為重組蛋白質(zhì)藥物的最好平臺之一。雖然植物技術(shù)平臺相對于微生物和動物細胞技術(shù)平臺具有較多的優(yōu)勢,但利用植物生物反應器生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品(plant-made pharmaceutical,PMP)的植物源生物藥物的安全性較為關注。通常,影響生物藥物的安全性主要來源于與宿主相關、藥物相關和加工相關雜質(zhì),由于植物細胞的重組蛋白的糖苷修飾與人類具有相似的糖骨架,但在巖藻糖和木糖的修飾存在差異,因此植物糖修飾的免疫原性成為與藥物相關的雜質(zhì),是水稻胚乳細胞生產(chǎn)生物醫(yī)藥的關鍵因子之一�，F(xiàn)有研究結(jié)果表明水稻胚乳表達OsrHSA具有高效、穩(wěn)定和經(jīng)濟有效,水稻種子中蛋白N-糖基化模式較為簡單。由于不同的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)具有糖苷修飾差異,植物中生產(chǎn)的生物藥物的糖基化將植物特異性N-聚糖殘基,αa-1,3-巖藻糖和β-1,2-木糖添加到最終的糖基化產(chǎn)物中。這些植物特異性N-聚糖的存在可以顯著改變生物藥物的穩(wěn)定性和活性,一些研究已經(jīng)證明,通過基因工程在植物中通過人源糖基化類型生產(chǎn)藥物可以改變植物細胞的N-糖基化結(jié)構(gòu)。人血漿主要由人血清白蛋白的蛋白質(zhì)組成,它是一種單體非糖基化蛋白質(zhì)。它常以高劑量用于治療各種疾病和傷害,如手術(shù)失血,血容量不足,嚴重燒傷等引起的貧血。作為血漿來源的HSA替代物,重組人血清白蛋白是一種安全性高并且供應來源廣泛的生物制藥。中國已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中大規(guī)模生產(chǎn)了的植物源重組人血清白蛋白(human serum albumin from Oryza Sativa,OsrHSA)OsrHSA,并且最近中國食品藥品監(jiān)督管理局批準它在中國進行臨床試驗,OsrHSA的HCPs安全性則是其中的一個關鍵問題。研究結(jié)果表明:OsrHSA與血漿來源人血白蛋白(Plasma HSA)在理化和物理性質(zhì)上完全相同或相似。因此,OsrHSA的安全性問題不是來自HSA木身,而是來自OsrHSA加工過程中產(chǎn)生的雜質(zhì),尤其是殘留宿主細胞蛋白(Host Cell Proteins,HCPs)。但是HCP不可能在下游加工過程中徹底去除。雖然OsrHSA中的殘留HCP控制在低至1.5|μg/g的濃度,但由于HSA在臨床應用中臨床劑量超過50克以上,總HCP含量仍然很高。通常,生物藥的安全性不僅受HCP水平,還受其種類的影響。雖然許多復雜方法已被用于去除和降低HCPs含量,但由于不能完全排除這些雜質(zhì),殘留HCPs作為關鍵質(zhì)量屬性(Critical Quality Attributes,CQA)之一。而HCPs潛在的免疫原性是在OsrHSA臨床應用中最關注的風險。因此,將OsrHSA中殘留的HCPs作為CQA的表征以及通過不同方法評估免疫原性非常重要。目前為止,關于OsrHSA中HCPs的免疫原性尚沒有報道,對殘留HCPs的免疫原性在臨床前或臨床試驗的相關研究也未見報道。因此,利用動物系統(tǒng)的臨床前試驗研究獲得OsrHSA中的HCP的免疫原性和免疫毒性的直接證據(jù)顯得至關重要。在本研究中,針對水稻胚乳細胞生物反應器的蛋白藥物中與宿主相關的主要成分之一 HCPs安全性和與藥物相關的植物類型N-糖苷的人源化進行了研究。首先,我們使用Sprague-Dawley大鼠評估了 OsrHSA及其殘留HCPs的免疫原性和細胞毒性進行系統(tǒng)評價,對包括對動物主動脈血樣進行血液學和生化分析、細胞因子、C-反應蛋白(CRP)和血漿循環(huán)免疫復合物、補體和抗藥物抗體(ADA)的等關鍵性安全指標進行了分析。然后采用TALENs基因組編輯技術(shù),對水稻胚乳細胞的人源化糖苷修飾進行遺傳改造,以期獲得具有人源巖藻糖結(jié)構(gòu)和半乳糖、唾液酸結(jié)構(gòu)的糖苷結(jié)構(gòu)。在水稻基因組內(nèi)分別敲除α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,3-fucosyltransferase,OsFUT)或β-1,2-木糖基轉(zhuǎn)移酶(β-1,2-xylosyltransferase,OsXylT)基因,同時將人的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)和人的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(GalT)導入水稻基因組。主要結(jié)果如下:HCP組或陰性對照組中均未觀察到動物死亡或異常反應。所有處理組的體重均有增加,但在D42與對照組未見明顯的體重增加。實驗發(fā)現(xiàn),雄性動物體重的上升趨勢遠高于雌性動物,而HCP組的體重與陰性對照組相比較并沒有顯著變化。在HCP和陰性對照血液學和凝血相關參數(shù)也沒有顯著差異。結(jié)果表明:與陰性對照相比,OsrHSA的殘留HCP不會引起任何血液生化的改變。對HCP的免疫毒性評估結(jié)果,通過監(jiān)測CD4+和CD8 + T細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在給藥后的D15,HCP組與陰性對照組相比時,CD8 + T細胞沒有顯著差異。然而,給藥后的D15,CD4 + T細胞和CD4 +/CD8 + T細胞比例在HCP組中與陰性對照組之間存在顯著差異。盡管在D15的CD4 +/CD8+比例有實質(zhì)性差異,但淋巴細胞百分比仍處于臨床正常范圍,這些變化并未顯示藥物劑量與給藥時間之間的相關性。因此,我們并不認為這些變化與這種藥物的免疫毒性有關。通過進一步對與炎癥高度相關的IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,TNF-α,IFN-y和IL-1β等細胞因子進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCP組中沒有檢測到這8種細胞因了,表明OsrHSA的HCPs沒有免疫毒性,也不可能出現(xiàn)細胞因子風暴的風險。為了研究水稻殘留HCP的免疫原性,我們研究了 HCP特異性抗體,在給藥后第14天,第28天和第41天分別檢測了抗HCP、抗人血清白蛋白和抗OsrHSA的特異性抗體的效價和發(fā)生率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給藥后D41時,只有少數(shù)動物在OsrHSA和pHSA中檢測到HCP特異性抗體,其發(fā)生率為在2/10,滴度均小于1.0,盡管檢測到了特異性抗體,但發(fā)生率和滴度均較低,結(jié)果表明HCP具有較低的免疫原性。C-反應蛋白(C-reaction protein,CRP)水平會隨著炎癥發(fā)展而增加。在給藥后D15時,OsrHSA組的雄性動物中CRP不但沒有升高,反而有顯著降低,并且在給藥后42天時,OsrHSA和pHSA兩中的CRP都顯著降低。然而雌性動物的CRP顯著降低;但這種變化與藥物和給藥時間之間沒有相關性。CIC水平的上升作為抗藥物抗體(Anti-drugantibody,ADA)發(fā)展的先決條件,我們檢測了HCP的ADA,我們在給藥后D15和D42天分別檢測了CIC的水平。與陰性對照組相比,HCP組沒有觀察到任何與藥物相關的CIC變化。進一步評估響應于HCP抗原的免疫激活反應,我們檢測了補體3和補體4,結(jié)果表明:在pHSA組的補體3水平在給藥后D15和D42較對照顯著下降,而僅在給藥后D42時,補充3水平僅在OsrHSA組的雌性動物有所增高,但所有處理組均沒有檢測到補體4。為了探討在OsrHSA高劑量組可能引起的病理變化,我們對高劑量可能引起病理變化的肝、腎和脾臟等靶器官進行了組織學觀察。在HCP組和陰性對照之間未觀察到與藥物相關的顯著病理學差異,也沒有發(fā)現(xiàn)HCP組的器官重量和系數(shù)比率的顯著變化。對pHSA和OsrHSA高劑量處理組的病理學觀察結(jié)果,在OsrHSA和pHSA組里發(fā)現(xiàn)了與藥物相關的包括肝、脾和腎的器官/體重比增加;在OsrHSA和pHSA組觀察到了肝細胞肥大,肝/脾造血,腎小球系膜細胞增殖和基質(zhì)擴大,腎小管和腎小管變性/再生等在內(nèi)的病理學變化。其發(fā)生率和嚴重程度與劑量高度相關,這可能是由于蛋白質(zhì)過載引起滲透壓增加從而降低肺功能所致,這些病變與每天高劑量注射白蛋白后的生物學特征一致。由于HSA主要用于治療低血容量患者,因此這種現(xiàn)象不可能發(fā)生在病人身上。除腎小管病變在給藥后D43后沒有得到恢復外,其余病變均得到了恢復,這表明這些變化是一種可逆性反應,但這些病理學變化在OsrHSA和pHSA二者之間沒有顯著差異,表明OsrHSA與pHSA具有相似的毒性反應,說明OsrHSA是安全。為了在植物細胞中獲得人源化的糖苷修飾,我們采用TALEN技術(shù)對水稻胚乳細胞編碼糖苷修飾的酶進行遺傳改造,總共構(gòu)建了 9個靶向OsFUT的TALEN載體和11個靶向OsXylT基因TALEN載體,進行了水稻轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化。我們先鑒定hpt的陽性轉(zhuǎn)化植株,在此基礎上,從hpt陽性植物中進一步篩選鑒定出GalT或FUT8陽性轉(zhuǎn)基因植株,最終從67個hpt陽性轉(zhuǎn)基因植株中獲得了10個FUT8陽性轉(zhuǎn)基因植株,從207個hpt陽性轉(zhuǎn)基因植株中獲得了46個GaIT陽性轉(zhuǎn)基因植株;使用特定引物進一步鑒定目標基因是否通過NHEJ機制整合到由TALENs創(chuàng)建的DSB中,不幸的是,結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)人類GalT或FUT8的插入到TALEN的靶標位點,顯示設計的TALEN可能沒有產(chǎn)生DSB。結(jié)果表明獲得的GalT或FUT8的轉(zhuǎn)基因植株均是通過隨機方式整合到水稻基因組。隨后,我們采用蛋白質(zhì)印跡法對GalT或FUT8的陽性轉(zhuǎn)基因株系的的表達進行了檢測,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):從10個FUT8陽性轉(zhuǎn)基因品系檢測到了3個轉(zhuǎn)基因株系的胚乳中表達了FUT8,從46個GalT陽性轉(zhuǎn)基因株系的胚乳中中檢測到GalT的表達。進一步確定在表達FUT8和GalT蛋白的種子蛋白是否發(fā)生了N-糖基化結(jié)構(gòu)改變,以TP309作為對照,采用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對陽性株系的糖苷結(jié)構(gòu)進行了分析。結(jié)果顯示所有表達FUT8的轉(zhuǎn)基因品系種子均顯示出不同的植物特異性N-糖苷結(jié)構(gòu);在過表達FUT8的轉(zhuǎn)基因品系FF1-141-6的種子中,植物類型的糖苷結(jié)構(gòu)較TP309顯著降低了5%,只含木糖殘基/無巖藻糖的N-糖苷如GnMX,MMX和GnGnX的總量顯著降低,植物特異性糖苷的減少可能是由于哺乳動物特異性FUT8編碼的基因表達所致。值得注意的是,在過表達GalT的轉(zhuǎn)基因系胚乳中的植物類型N-糖苷的顯著減少。可能是在胚乳中過表達人GalT基因,其機理可能是作用于GlcNAcMan5GlcNAc2的中心結(jié)構(gòu)域并抑制植物類型N-糖苷的形成。我們發(fā)現(xiàn)在XG4-133-1和XG2-118-9轉(zhuǎn)基因品系胚乳中缺少一種或兩種植物特異性N-糖苷結(jié)構(gòu)。在這個品系除了顯著減少的植物類型N-糖苷結(jié)構(gòu)之外,還檢測到了人源特異性的半乳糖基化和唾液酸化的N-糖苷結(jié)構(gòu)。在XG2-118-9轉(zhuǎn)基因系中,在81%哺乳動物N-糖苷的26.44%糖苷被唾液酸化,這是首次在水稻胚乳細胞表達GalT基因產(chǎn)生了唾液酸化的糖苷結(jié)構(gòu)。由于半乳糖基化結(jié)構(gòu)作為唾液酸化的受體底物,早期研究報道在玉米、小麥和大麥等谷物作物物缺乏唾液酸化合成途徑的相關基因,在植物中實現(xiàn)唾液酸化的N-糖苷較為困難。另一方面,已有報道在水稻基因組存在編碼類似唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因,在我們結(jié)果中,在轉(zhuǎn)基因水稻中過量表達GalT,獲得了具有唾液酸糖苷結(jié)構(gòu)的N-糖苷,說明在水稻中較其他谷物作物具有更大的優(yōu)勢。由于糖基化藥物的唾液酸化影響其循環(huán)半衰期和生物活性,在植物生物藥物中的唾液酸與否是植物生物反應器與動物反應器的最重要差別。我們的結(jié)果提供了人源化糖苷修飾可在水稻胚乳細胞中實現(xiàn)的證據(jù),也再次證明水稻基因組的唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以通過表達供唾液酸化的底物半乳糖來實現(xiàn)植物細胞的人源化糖苷修飾。綜上所述,我們結(jié)果表明OsrHSA中的殘留HCP的免疫原性較低,OsrHSA的安全性與血漿來源HSA相同。我們還證實了OsrHSA中的殘留HCP對人體是安全的假說,再次證明水稻胚乳細胞是最適合的分子醫(yī)藥宿主之一。此外,在水稻胚乳細胞過表達人半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GalT)可以為唾液酸化提供半乳糖苷底物,并獲得人特異的唾液酸糖苷結(jié)構(gòu)和同時降低β-1,2-木糖含量。這些結(jié)果證明了 OsrHSA的HCP具有較低的免疫原性和免疫毒性,植物類型N-糖苷可以通過基因工程技術(shù)獲得人源化的糖苷結(jié)構(gòu)。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R91
，

本文編號：2624308