【摘要】：目的：干擾素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎（ChronicHepatitis B，CHB）和慢性丙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）抗病毒治療過(guò)程中一個(gè)重要的組成部分。在抗乙型肝炎病毒藥物中，IFN與核苷（酸）類(lèi)似物相比具有療程短、停換藥方便等優(yōu)勢(shì)；在慢性丙型病毒肝炎治療中，IFN聯(lián)合利巴韋林還是其標(biāo)準(zhǔn)治療方案。雖然目前已有數(shù)十種干擾素被發(fā)現(xiàn)，然而在中國(guó)僅有隸屬于Ⅰ型干擾素的IFN-α應(yīng)用到病毒性肝炎的抗病毒治療中。但是，在此治療過(guò)程中僅有30%-40%CHB患者能達(dá)到e抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，約有60%的患者對(duì)其治療應(yīng)答不佳；而且有50%-60%的基因1型CHC患者無(wú)法得到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SustainedVirological Response，SVR）。與此同時(shí)，由于IFN-α的諸多副作用，部分患者在治療過(guò)程中還因?yàn)閲?yán)重的副反應(yīng)而終止治療。近期研究發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶18（Ubiquitin-specific protease18，USP18）是IFN-α療效的重要影響因子，并且進(jìn)一步研究證實(shí)USP18是IFN-α治療效果的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。IFN-λ是最新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型干擾素，隸屬于Ⅲ型干擾素；與IFN-α類(lèi)似它也是通過(guò)激活JAK-STAT（Janus activated kinase-signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT）通路并調(diào)控一系列抗病毒蛋白如：雙鏈RNA依賴(lài)的蛋白激酶R（PKR)和抗黏病毒蛋白（mixovirus resistanceprotein A，MxA）來(lái)發(fā)揮抗病毒作用。最新體外研究發(fā)現(xiàn)在IFN-α應(yīng)答不佳的細(xì)胞中IFN-λ仍然可以發(fā)揮抗病毒作用。關(guān)于USP18在IFN-α的抗病毒通路中的研究進(jìn)展很多，但對(duì)于其在IFN-λ的抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的影響報(bào)道甚少。本研究旨在探討USP18對(duì)IFN-α和IFN-λ抗病毒信號(hào)通路的不同影響及其臨床意義。 方法：復(fù)蘇Huh-7細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后分為空白對(duì)照組、IFN-α實(shí)驗(yàn)組和IFN-λ實(shí)驗(yàn)組。 1IFN-α實(shí)驗(yàn)組給予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實(shí)驗(yàn)組給予IFN-λ1（10ng/ml）進(jìn)行刺激，空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)并加入等體積無(wú)菌生理鹽水，分別于6h，12h，24h，，48h后收細(xì)胞。 2空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無(wú)菌生理鹽水，IFN-α實(shí)驗(yàn)組給予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實(shí)驗(yàn)組給予IFN-λ1（10ng/ml）進(jìn)行刺激12小時(shí)，然后三組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無(wú)干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，然后分別再次給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）和IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后收細(xì)胞。 3空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無(wú)菌生理鹽水，IFN-α實(shí)驗(yàn)組給予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ實(shí)驗(yàn)組給予IFN-λ1（10ng/ml）進(jìn)行刺激12小時(shí)，然后三組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無(wú)干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，然后再分別給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-λ1（10ng/ml）和IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后收細(xì)胞。 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)（Real Time-quantitative Polymerase ChainReaction, RT-qPCR）法檢測(cè)Huh-7細(xì)胞USP18、STAT1、PKR和MxA的mRNA表達(dá)水平。Western-blot檢測(cè)USP18、P-STAT1、STAT1、PKR及MxA的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1不同干擾素刺激時(shí)間（6h，12h，24h，48h）各組Huh-7細(xì)胞指標(biāo)的變化： 1.1各組細(xì)胞USP18的表達(dá)變化： 隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α實(shí)驗(yàn)組和IFN-λ實(shí)驗(yàn)組Huh-7細(xì)胞內(nèi)USP18mRNA的表達(dá)增加，但I(xiàn)FN-α組比IFN-λ組增加更為明顯且在24h、48h USP18mRNA的表達(dá)明顯高于IFN-λ組（5.33±0.47VS4.60±0.42，5.41±0.46VS4.76±0.78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。此外，IFN-α組和IFN-λ組細(xì)胞的USP18mRNA均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細(xì)胞內(nèi)USP18蛋白的表達(dá)也開(kāi)始增加，IFN-α組比IFN-λ組增加更明顯且在48h時(shí)USP18蛋白的升高明顯大于IFN-λ組（1.61±0.04VS1.46±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 1.2不同刺激時(shí)間各組細(xì)胞STAT1、PKR和MxA的表達(dá)變化以及STAT1磷酸化蛋白的變化： 1.2.1隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細(xì)胞內(nèi)STAT1、PKR和MxA mRNA表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且在刺激12h時(shí)IFN-α組STAT1、PKR和MxA mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，且明顯高于IFN-λ組（5.61±0.44VS4.84±0.33，5.42±0.37VS4.68±0.15，3.82±0.35VS3.23±0.46），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.01）。隨后，IFN-α組的STAT1、PKR和MxA mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而IFN-λ組的表達(dá)繼續(xù)上升并在24h時(shí)達(dá)到高峰，并且高于IFN-α組（5.30±0.15VS5.95±0.37，4.81±0.43VS5.81±0.40，3.37±0.46VS4.63±0.62），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.01）。此后兩組的STAT1、PKR和MxA mRNA表達(dá)開(kāi)始下降，但48h IFN-λ組仍高于IFN-α組。各組Huh-7細(xì)胞STAT1、PKR和MxA蛋白水平變化與mRNA表達(dá)變化類(lèi)似。 1.2.2隨著干擾素刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN-α組和IFN-λ組Huh-7細(xì)胞內(nèi)STAT1磷酸化蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。IFN-α組的STAT1磷酸化蛋白表達(dá)水平高于IFN-λ組，并且在刺激12h時(shí)IFN-α組STAT1磷酸化蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高，且明顯高于IFN-λ組（1.19±0.02VS0.63±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。隨后，IFN-α組STAT1磷酸化蛋白表達(dá)開(kāi)始下降，IFN-λ組的表達(dá)繼續(xù)上升并在24h時(shí)達(dá)到高峰，并且高于IFN-α組（0.71±0.01VS1.25±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2三組細(xì)胞分別給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）進(jìn)行刺激12h后更換無(wú)干擾素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)16h后再次給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后細(xì)胞各個(gè)指標(biāo)的變化。 2.1各指標(biāo)mRNA表達(dá)的變化： IFN-α組的USP18mRNA表達(dá)高于IFN-λ組（4.04±0.39VS3.25±0.26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。IFN-α組STAT1、PKR、MxA的mRNA表達(dá)均低于IFN-λ組（4.71±0.28VS6.54±0.26，3.71±0.25VS5.41±0.32，2.91±0.23VS4.31±0.19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）。 2.2各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化： IFN-α組的USP18蛋白表達(dá)高于IFN-λ組（1.93±0.15VS1.82±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。IFN-α組STAT1、P-STAT1、PKR、MxA的蛋白表達(dá)均低于IFN-λ組分別為（1.13±0.16VS1.61±0.17，1.12±0.18VS1.49±0.15，1.31±0.13VS1.91±0.16，1.09±0.19VS1.59±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）。 3三組細(xì)胞分別給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-α2a（20IU/ml）、IFN-λ1（10ng/ml）進(jìn)行刺激12h后更換無(wú)干擾素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)16h后再給予無(wú)菌生理鹽水、IFN-λ1（10ng/ml）、IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后細(xì)胞各個(gè)指標(biāo)的變化。 3.1各指標(biāo)mRNA表達(dá)的變化： IFN-α組的USP18mRNA表達(dá)與IFN-λ組（3.54±0.28VS3.46±0.31）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。IFN-α組STAT1、PKR和MxA的mRNA表達(dá)低于IFN-λ組（5.69±0.22VS5.81±0.33，4.31±0.20VS4.76±0.26，3.49±0.27VS3.80±0.20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）。 3.2各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化： IFN-α組USP18蛋白表達(dá)低于IFN-λ組（1.76±0.16VS1.90±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。兩組細(xì)胞P-STAT1表達(dá)無(wú)差異（1.29±0.15VS1.30±0.19，P0.05）。IFN-α組PKR、MxA蛋白表達(dá)低于IFN-λ組（1.40±0.10VS1.49±0.14，1.23±0.11VS1.42±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）。 結(jié)論： 1在Huh-7細(xì)胞內(nèi)IFN-λ的抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不受USP18的影響。 2在對(duì)IFN-α刺激不敏感的Hun-7細(xì)胞中IFN-λ仍能激活抗病毒信號(hào)通路，促進(jìn)抗病毒蛋白的生成。 3IFN-α刺激Huh-7細(xì)胞后抗病毒蛋白生成迅速，但消退速度也快；而IFN-λ刺激后抗病毒蛋白的生成相對(duì)緩慢，但持續(xù)的時(shí)間更加的持久。 4重復(fù)使用IFN-α刺激Huh-7細(xì)胞后USP18水平明顯升高，抗病毒蛋白生成減少。 5重復(fù)使用IFN-λ刺激Huh-7細(xì)胞USP18的升高不明顯，抗病毒蛋白生成未見(jiàn)減少。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R978.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張磊;鄧杰;田莉;曹琳;;液體穩(wěn)定干擾素及其相關(guān)研究[J];藥物生物技術(shù);2005年06期

2 侯云德;;干擾素及其臨床應(yīng)用 一 干擾素概述、定義和分類(lèi)[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2007年04期

3 王春穎;楊友國(guó);劉成永;王驥;王海艦;周冬青;侯遠(yuǎn)沛;;乙型肝炎病毒基因型與干擾素-α2b療效的關(guān)系[J];實(shí)用肝臟病雜志;2007年06期

4 張力;任曉華;李敏然;劉燕玲;王素玲;王永;劉紅磊;;干擾素-α1b聯(lián)合安琺特治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究[J];河北醫(yī)藥;2008年10期

5 李金科;杜曉娟;朱琳;占國(guó)清;李芳;江山;;干擾素-α聯(lián)合肝康Ⅱ?qū)σ倚透窝赘卫w維化指標(biāo)影響[J];山西醫(yī)藥雜志(下半月刊);2010年10期

6 李強(qiáng);韓靄辰;鄭博;王勁峰;;干擾素的基礎(chǔ)與應(yīng)用進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年02期

7 劉鳳云;;低劑量干擾素-α用于癌癥患者有同樣的生物學(xué)效應(yīng)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));1988年02期

8 湯立軍,陳漢春;干擾素-α治療慢性粒細(xì)胞白血病的療效及機(jī)理[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);1999年05期

9 張麗蘭;;干擾素及其臨床應(yīng)用 三 干擾素-α(interferon alpha,IFN-α)[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2007年04期

10 陳景樂(lè);苗嘉恒;袁偉恩;吳飛;金拓;;穩(wěn)定干擾素-α-2b的多糖玻璃體顆粒的研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 冼建中;張復(fù)春;易俊卿;;干擾素-γ與干擾素-α治療慢性乙型肝炎肝纖維化的對(duì)比研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

2 冼建中;張復(fù)春;易俊卿;;干擾素-γ與干擾素-α治療慢性乙型肝炎肝纖維化的對(duì)比研究[A];第一次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 姚慧;夏強(qiáng);曹春梅;金紅峰;單綺嫻;;慢性應(yīng)用干擾素-α減弱大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性的舒張作用[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第六屆應(yīng)用生理學(xué)委員會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

4 陶冶;湯雄;;干擾素-α1b治療慢性乙型肝炎患者對(duì)血清肝纖維化標(biāo)記物的影響[A];江西省第四次中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2011年

5 趙鴻;林溫玉;王貴強(qiáng);Raymond T.Chung;;SART1是干擾素-α抗丙型肝炎病毒作用中不可缺少的人類(lèi)基因[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四次全國(guó)感染性疾病中青年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

6 張春平;顧雪芬;李丹;;拉米夫定與干擾素-α-2b聯(lián)合治療HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎療效觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國(guó)第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 鄭水兒;金潔;童向民;錢(qián)文斌;薛永權(quán);;干擾素-α聯(lián)合GM-CSF誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞分化[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

8 崔國(guó)惠;陳燕;吳青;李新剛;;干擾素-α聯(lián)合姜黃素對(duì)B-NHL淋巴瘤Raji細(xì)胞的增生抑制作用[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

9 曾云;李惠民;郝萍;李繼梅;唐睿珠;楊凌;周征;黃勇;王枚;姜爾烈;;觀察白介素-2聯(lián)合干擾素-α對(duì)與K562細(xì)胞互培養(yǎng)的白血病緩解期外周血淋巴細(xì)胞免疫表型的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 唐志堅(jiān);ASCO會(huì)議關(guān)注泌尿生殖道腫瘤研究進(jìn)展[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2008年

2 記者 曹繼軍 顏維琦;“干擾素—α”可治療肝炎之謎被解開(kāi)[N];光明日?qǐng)?bào);2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 蔣艷博;基于蛋白質(zhì)—金屬配合物的干擾素緩釋傳遞系統(tǒng)的研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2011年

2 程功;家豬I型干擾素多基因家族的結(jié)構(gòu)和特性及干擾素-alpha對(duì)口蹄疫基因工程疫苗的免疫增強(qiáng)作用[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 韓靄辰;重組人干擾素-α2b分離純化的研究[D];天津大學(xué);2013年

2 萬(wàn)劉靜;口服微囊化干擾素的制備及其性能研究[D];重慶理工大學(xué);2014年

3 陳振花;基于報(bào)告基因和干擾素-α信號(hào)通路的藥物篩選[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2005年

4 劉志瑩;干擾素及其受體在乙型肝炎病毒相關(guān)腎炎患兒腎組織中表達(dá)情況的研究[D];南昌大學(xué);2008年

5 盧年芳;不同亞型干擾素-α抗乙型肝炎病毒活性的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

6 張文靜;新一代長(zhǎng)效干擾素的研發(fā)—干擾素-α的表達(dá)純化及活性測(cè)定[D];天津大學(xué);2009年

7 陸泳旭;重組人干擾素-α2b的純化以及位點(diǎn)特異性PEG化研究[D];天津大學(xué);2010年

8 張坤坤;USP18在干擾素-α治療慢乙肝過(guò)程中的預(yù)測(cè)意義及作用機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

9 鄭博;重組人干擾素-α2b位點(diǎn)特異性的PEG化修飾[D];天津大學(xué);2013年

10 朱戰(zhàn)濤;USP18對(duì)干擾素α和干擾素λ抗病毒信號(hào)通路的影響及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2524915