【摘要】：乳腺癌是導致婦女癌癥死亡的第二大原因。乳腺癌中發(fā)生乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene,BRCA1)和BRCA2基因突變的攜帶者高達45-80%,且存活率非常低。目前臨床上尚無根治BRCA基因突變型乳腺癌的有效療法,所以有效治療藥物的研發(fā)極為迫切。BRCA1和BRCA2基因在細胞生長過程中對維持基因組的穩(wěn)定性起著重要作用,其突變與乳腺癌發(fā)病高度相關。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)是存在于真核細胞的參與DNA修復的核酶,主要與堿基切除修復(base excision repair,BER)中的DNA單鏈損傷修復密切相關。當它被抑制時,因BER缺陷會導致細胞內(nèi)產(chǎn)生大量不能及時修復的DNA單鏈損傷,從而產(chǎn)生大量DNA雙鏈損傷(double strand breaks,DSB)。這些DNA雙鏈損傷在正常細胞內(nèi)可以通過BRCA1/2等因子共同參與介導的高保真同源重組(homologous recombination,HR)途徑得到修復;而在BRCA基因缺陷的腫瘤細胞內(nèi),由于缺少HR修復途徑,造成DSB不能修復或者由容易出錯的非同源重組末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)修復,從而大大增加了BRCA缺陷的腫瘤細胞的死亡概率,稱為協(xié)同致死作用。PARP抑制劑正是通過上述的協(xié)同致死作用對BRCA基因缺陷的卵巢癌和乳腺癌發(fā)揮藥理作用的。本研究對前期篩選獲得的在酶水平具有較強PARP抑制活性的26個新結構化合物(AZD2281的類似物)進一步進行體內(nèi)和體外抗腫瘤活性的篩選與評價,并對其抗腫瘤作用的特點和機制進行探索,旨在獲得對BRCA突變?nèi)橄侔┚哂休^好治療前景的PARP抑制劑提供實驗依據(jù)。一、PARP抑制劑的體外抗腫瘤活性篩選與評價本部分通過觀察PARP抑制劑單用對BRCA突變腫瘤細胞的藥效以及與DNA烷化劑替莫唑胺合用對BRCA非突變腫瘤細胞的藥效,從26個新結構化合物中篩選活性較好的化合物進行后續(xù)的篩選與評價。1.PARP抑制劑單用對BRCA突變腫瘤細胞的影響本部分通過檢測細胞活力及凋亡考察PARP抑制劑單用對BRCA突變腫瘤細胞的影響,篩選活性較好的化合物。1.1 PARP抑制劑單用對BRCA突變腫瘤細胞增殖的影響選用人源BRCA突變的乳腺癌細胞系MDA-MB-436細胞,采用CCK-8法檢測26個受試化合物與已上市的PARP抑制劑奧拉帕尼(Olaparib/AZD2281,Lynparza)單獨使用時的細胞存活的影響。結果表明,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)、XML12022901(化合物13)和XML12032104(化合物19)等15個化合物可顯著抑制MDA-MB-436細胞的增殖,IC50在15-70μM之間,與陽性藥AZD2281的作用強度接近。1.2.PARP抑制劑單用對BRCA突變腫瘤細胞凋亡的影響采用BRCA突變的乳腺癌細胞系MDA-MB-436細胞,通過流式細胞術觀察了上述15個具有較強體外抑瘤作用的PARP抑制劑對細胞凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn),XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)等9個化合物能不同程度地增高細胞晚期凋亡率,且具有明顯濃度依賴性,提示它們具有誘導晚期細胞凋亡作用。2.PARP抑制劑與替莫唑胺合用對非BRCA突變腫瘤細胞增殖的影響采用CCK-8法觀察了受試化合物與烷化劑類抗腫瘤藥物替莫唑胺合用時對人源的肺腺癌細胞系A549細胞活力的影響。研究發(fā)現(xiàn),XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)等7個化合物與替莫唑胺合用具有一定的增效作用。綜合考慮化合物單用與合用的結果以及結構多樣性和成藥的難易程度等因素,本研究進而選擇體外抗腫瘤活性較好的化合物5和化合物19,在整體動物水平初步評價了它們的抗腫瘤活性。二、PARP抑制劑體內(nèi)抗腫瘤活性評價本部分選擇PARP抑制劑XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19),在人源BRCA突變的乳腺癌細胞系MDA-MB-436移植瘤模型上,評價它們的體內(nèi)抗腫瘤活性。首先建立BALB/C裸小鼠乳腺癌異種移植瘤模型,進而觀察灌胃給予PARP抑制劑23天對腫瘤生長的影響。結果發(fā)現(xiàn),給藥23天后陽性對照藥AZD2281(50mg/kg)和受試化合物5(50mg/kg)及化合物19(50mg/kg)都能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長,抑瘤率分別為80.6%、73.6%、88.8%。各給藥組腫瘤體積均明顯小于溶劑對照組,且體重無明顯下降,腫瘤也無轉移。結果提示,化合物5和化合物19在整體動物水平對BRCA突變的乳腺癌具有明顯抑制作用。三、PARP抑制劑的作用機理研究本部分主要通過考察PARP抑制劑對BRCA突變及非突變腫瘤細胞的作用差異,研究PARP抑制劑通過協(xié)同致死作用發(fā)揮抗腫瘤藥效的作用機制。1.PARP抑制劑對BRCA突變及非突變腫瘤細胞增殖的影響采用CCK-8法觀察篩選獲得的4個高活性化合物5、7、13、19對人源的BRCA突變?nèi)橄侔┘毎礛DA-MB-436及BRCA非突變?nèi)巳橄侔┘毎礛DA-MB-231和MCF-7細胞增殖的作用。結果發(fā)現(xiàn),四個化合物對MDA-MB-436細胞具有選擇性抑制作用,而對MDA-MB-231、MCF-7細胞的增殖抑制作用較弱。提示4個化合物對BRCA突變細胞的抑制作用均強于其對于非BRCA突變細胞的抑制作用,提示它們在抗BRCA突變?nèi)橄侔┲芯哂羞M一步研究的價值。2.PARP抑制劑對BRCA突變及非突變腫瘤細胞凋亡的影響進一步采用流式細胞術檢測4個化合物對人BRCA突變的乳腺癌細胞系MDA-MB-436和BRCA非突變?nèi)巳橄侔┘毎礛CF-7細胞凋亡的影響。研究結果表明,化合物5、7、19能夠明顯誘導MDA-MB-436細胞晚期凋亡,且呈濃度依賴性,100μM細胞凋亡率高達80%左右。而PARP抑制劑1~100μM在MCF-7細胞凋亡率都不到25%�；衔�13對兩種細胞凋亡都沒有明顯影響。提示上述3個化合物能夠通過選擇性誘導BRCA突變細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,這可能是它們選擇性抑制BRCA突變細胞增殖的重要機制之一。3.PARP抑制劑對BRCA突變及非突變腫瘤細胞周期的影響采用流式細胞術檢測化合物5、7、13、19對人源的BRCA突變的乳腺癌細胞系MDA-MB-436細胞和BRCA非突變?nèi)巳橄侔┘毎礛CF-7細胞周期的影響。結果顯示,化合物5、7、19能濃度依賴性誘導MDA-MB-436和MCF-7細胞周期阻滯在G2期和S期�；衔�13對兩種細胞周期都沒有明顯影響。提示化合物5、7、19可能通過將腫瘤細胞阻滯在G2期和S期發(fā)揮抗腫瘤作用,但對BRCA突變及非突變腫瘤細胞無選擇性。4.PARP抑制劑對BRCA突變細胞中PAR蛋白表達的影響ADP核糖聚合物(poly(ADP-ribose),PAR)蛋白含量是反映DNA損傷修復程度的重要指標。采用Western blotting檢測化合物5、7、13、19對人源的BRCA突變的乳腺癌細胞系MDA-MB-436細胞中PAR蛋白的表達。結果發(fā)現(xiàn),隨著PARP抑制劑(化合物5、7、19)濃度的升高,PAR的表達量呈逐漸降低趨勢�；衔�13對PAR蛋白的表達無明顯影響。提示化合物5、7、19可能通過抑制PAR蛋白的表達,致使腫瘤細胞的DNA損傷修復減少,從而導致細胞死亡。綜上所述,本論文可以得出以下結論:1.在26個分子水平抑酶活性較好的PARP抑制劑中,XML120104-C(化合物5)、XML12021502(化合物7)和XML12032104(化合物19)可選擇性抑制BRCA突變的乳腺癌細胞系MDA-MB-436細胞的增殖,并誘導細胞凋亡,并呈濃度依賴性。2.PARP抑制劑XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19)能夠顯著抑制BRCA突變的乳腺癌異種移植瘤小鼠腫瘤的生長,其作用強度與AZD2281接近。3.PARP抑制劑單用對BRCA突變的腫瘤細胞具有選擇性抑制作用,其作用機制可能包括:(1)可選擇性誘導BRCA突變腫瘤細胞的晚期凋亡;(2)可非選擇性地將腫瘤細胞阻滯在G2和S期;(3)可能通過抑制PAR蛋白的表達使腫瘤細胞的DNA損傷修復減少,從而促進細胞死亡。綜上所述,本研究篩選獲得了XML120104-C(化合物5)和XML12032104(化合物19)等對BRCA突變的腫瘤細胞具有選擇性抑制作用的新PARP抑制劑,并發(fā)現(xiàn)化合物5和19在整體動物水平對裸鼠BRCA突變的移植瘤具有顯著抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)化合物5等PARP抑制劑抗腫瘤作用的機制可能是與誘導細胞凋亡、誘導細胞周期的阻滯、抑制PAR蛋白的表達進而阻斷DNA損傷修復相關。
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【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

【參考文獻】

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1 Yan Shi;Fang Zhou;Feng Jiang;Hong Lu;Jianjun Wang;Chuanyao Cheng;;PARP inhibitor reduces proliferation and increases apoptosis in breast cancer cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2014年02期

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本文編號：2444344