【摘要】：順鉑(Cisplatin, CP)是目前臨床上廣泛應用的抗腫瘤藥物之一,其抑癌作用與劑量成正比。但其在正常組織中的毒副作用,包括神經(jīng)毒性、耳毒性、腎毒性等,尤其是腎毒性,一定程度上限制了順鉑的應用。近年來研究表明,順鉑通過激活腎小管上皮細胞內復雜的信號通路導致腎小管上皮細胞損傷、凋亡以及壞死,其信號通路包括內質網(wǎng)應激和線粒體功能障礙。但目前對順鉑腎毒性確切細胞內信號及其機制尚未完全闡明。 內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ER stress, ERS)是指異常的細胞內環(huán)境影響內質網(wǎng)腔內蛋白質正常折疊,導致未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白在腔內聚集以及Ca2+平衡紊亂,最終引起內質網(wǎng)功能紊亂。多種腎臟疾病中存在內質網(wǎng)應激,如膜性腎病、先天性腎病綜合征、缺血性腎小管損傷等。內質網(wǎng)應激在順鉑腎損傷中的作用亦有報道。如順鉑處理腎小管細胞可誘導內質網(wǎng)伴侶分子葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)表達上調、內質網(wǎng)相關凋亡分子caspase-12活化。 Sigma-1受體分子(sigma-1receptor, Sig-1R)是內質網(wǎng)主要的伴侶分子,位于線粒體相關內質網(wǎng)膜(mitochondrion-associated ER membrane, MAM)上。 Sig-1R主要通過穩(wěn)定MAM上三磷酸肌醇受體(inositol trisphosphate receptor,IP3R),調節(jié)內質網(wǎng)與線粒體之間的Ca2+信號轉導,保護細胞活性。研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元細胞,激活Sig-1R能夠抑制缺血引起的Ca2+失衡,減輕細胞缺血性損傷。在大鼠肝臟缺血再灌注模型中,特異性配體激活Sig-1R后,可減輕肝臟缺血再灌注損傷。siRNA干擾人晶狀體細胞Sig-1R后,caspase-3活性增加。過表達Sig-1R能明顯抑制內質網(wǎng)應激,增加細胞活性。因此,我們設想,Sig-1R可通過阻斷內質網(wǎng)應激而對腎小管上皮細胞發(fā)揮保護作用。 線粒體是細胞的“能量工廠”,是合成ATP、電子傳遞和氧化磷酸化的主要場所。線粒體功能障礙在腎損傷中的作用已得到廣泛關注。在多種腎臟疾病模型中,均存在線粒體形態(tài)異常,并伴隨線粒體DNA突變、線粒體DNA拷貝數(shù)下降以及細胞凋亡。業(yè)已證明,線粒體功能障礙亦參與順鉑誘導的小管上皮細胞損傷。順鉑誘導腎小管上皮細胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增多、激活促凋亡蛋白如Bax.Bak,最終導致細胞凋亡。 內質網(wǎng)與線粒體是細胞內最重要的兩個細胞器,它們在功能與結構上都存在密切聯(lián)系。內質網(wǎng)和線粒體的交聯(lián)具有調節(jié)細胞Ca2+平衡、傳遞凋亡信號等功能�，F(xiàn)認為,線粒體內的Ca2+濃度與線粒體ATP合成、線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)的開放密切相關。Sig-1R通過穩(wěn)定IP3R參與線粒體Ca2+濃度調節(jié)。因此我們進一步推測,Sig-1R通過調節(jié)內質網(wǎng)與線粒體之間的Ca2+平衡,阻斷腎小管上皮細胞線粒體功能障礙,保護腎小管上皮細胞。第一部分內質網(wǎng)應激和線粒體功能障礙參與順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷目的：探討內質網(wǎng)應激以及線粒體功能障礙在順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷中的作用及其機制。方法：體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞,復習相關文獻并根據(jù)前期預實驗結果,應用不同劑量的順鉑(0、5、10、20μmol/L)刺激不同時間(0、6、12、24、48h)。采用real-time PCR檢測腎小管上皮細胞內質網(wǎng)伴侶分子GRP78、葡萄糖調節(jié)蛋白94(glucose regulated protein94,GRP94)、內質網(wǎng)促凋亡分子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷貝數(shù)的表達；western blot檢測腎小管上皮細胞上皮性鈣粘素(epithelial cadherin,E-cadherin)的表達；Annexin V-PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡；熒光探針Fluo-3/AM檢測胞漿Ca2+濃度；CCK-8檢測細胞活性；熒光探針DCHFDA染料檢測細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成；JC-1染色結合流式細胞術檢測線粒體膜電位。 結果：(1)順鉑可呈劑量及時間依賴性誘導腎小管上皮細胞活性下降、細胞凋亡增加、上皮性鈣粘附蛋白E-cadherin表達減少。與對照組相比,順鉑刺激24小時,細胞凋亡開始增加(增加了249.7%),E-cadherin表達開始減少(減少了38.1%)。(2)順鉑呈劑量依賴性誘導腎小管上皮細胞胞漿Ca2+超載,順鉑呈劑量和時間依賴性誘導腎小管上皮細胞內質網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94、內質網(wǎng)途徑凋亡分子CHOP表達增加,順鉑刺激12小時,GRP78、GRP94表達開始升高(分別升高了55.2%和54.2%),順鉑刺激24小時,內質網(wǎng)途徑凋亡分子CHOP表達開始增加(增加了118.7%),提示內質網(wǎng)應激發(fā)生時間早于腎小管上皮細膪損傷的發(fā)生時間。(3)順鉑呈劑量誘導腎小管上皮細胞ROS產(chǎn)生增加,順鉑呈劑量及時間依賴性誘導腎小管上皮細胞線粒體膜電位下降mtDNA拷貝數(shù)下降,順鉑刺激12小時,線粒體膜電位下降、mtDNA拷貝數(shù)開始下降(分別下降了33.0%和29.9%),提示線粒體功能障礙發(fā)生時間早于腎小管上皮細胞損傷的發(fā)生時間。 結論：內質網(wǎng)應激和線粒體功能障礙是順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷的早期事件,內質網(wǎng)應激和線粒體功能障礙參與順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷。 第二部分Sig-1R通過部分阻斷內質網(wǎng)應激減輕順鉑誘導腎小管上皮細胞損傷 目的：觀察內質網(wǎng)伴侶分子Sig-1R對順鉑誘導腎小管上皮細胞損傷和內質網(wǎng)應激的保護作用。 方法：體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞,瞬時轉染pcDNA3.0-Sig-1R或Sig-1RsiRNA質粒載體,再分別加入Cisplatin (10μmol/L)或生理鹽水(Saline)刺激24h。Sig-1R過表達分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R過表達、Cisplatin+Sig-1R過表達；Sig-1R干擾分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R干擾組、Cisplatin+Sig-1R干擾組。應用real-time PCR法檢測腎小管上皮細胞內質網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94.內質網(wǎng)促凋亡分子CHOP的表達；western blot法檢測腎小管上皮細胞E-cadherin、內質網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94、 Sig-1R、內質網(wǎng)凋亡分子CHOP、caspase-12的蛋白表達；Annexin V-PI雙染流式細胞儀和Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況；熒光探針Fluo-3/AM檢測胞漿Ca2+濃度；CCK-8檢測細胞活性；caspase-3的底物檢測其活性。體內實驗通過制備Sig-1R過表達轉基因小鼠,隨機分為4組：WT Saline組、WT Cisplatin組、Sig-1R transgenic Saline組、Sig-1R transgenic Cisplatin組。腹腔注射Cisplatin (20mg/kg)構建順鉑急性腎損傷小鼠模型,同時對照組腹腔注射Saline。于腹腔注射后72h處死小鼠,檢測尿蛋白/肌酐、血肌酐、血尿素氮水平；HE和PAS染色觀察腎組織病理形態(tài)學改變；檢測腎小管上皮細胞損傷及內質網(wǎng)應激的相關指標。 結果：(1)腎小管上皮細胞體外瞬時轉染Sig-1R siRNA后,其Sig-1R mRNA和蛋白的表達顯著下降。(2)Sig-1R siRNA轉染腎小管上皮細胞后再加入Cisplatin刺激,較未轉染Sig-1R siRNA的Cisplatin組,細胞活性下降35.2%(P0.05),細胞凋亡增加80.4%(P0.05)、caspase-3活化增加,E-cadherin表達減少,胞漿Ca2+濃度升高,(GRP78、GRP94、CHOP表達增加,caspase-12活化增加。(3)腎小管上皮細胞體外瞬時轉染pcDNA3.0-Sig-1R過表達Sig-1R, Real-time PCR和western blot結果顯示：腎小管上皮細胞Sig-1R mlRNA和蛋白的表達明顯升高。(4)與Cisplatin組相比較,過表達Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導的腎小管上皮細胞損傷,過表達Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導的細胞活性降低、細胞凋亡增加、E-cadherin表達下調、caspase-3活化增加。同時,Sig-1R過表達可部分逆轉Cisplatin誘導的腎小管上皮細胞胞漿Ca2+超載、GRP78、GRP94、CHOP表達上調、caspase-12活化增加。(5)體內實驗結果顯示,Sig-1R transgenic Cisplatin組小鼠較WT Cisplatin組,小鼠尿蛋白/肌、血肌酐和血尿素氮濃度分別降低67.7%、51.7%和75.4%(均P0.05)、NGAL、IL-18表達分別下降65.9%和37.4%(均P0.05)、細胞凋亡減少、CHOP表達下降、caspase-12活化減少,提示小鼠過表達Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導的急性腎損傷和腎組織內質網(wǎng)應激。 結論：Sig-1R通過部分阻斷內質網(wǎng)應激減輕順鉑誘導腎小管上皮細胞損傷。 第三部分Sig-1R通過部分阻斷線粒體功能障礙減輕順鉑誘導腎小管上皮細胞損傷 目的：觀察內質網(wǎng)伴侶分子Sig-1R對順鉑(Cisplatin)誘導腎小管上皮細胞線粒體功能障礙的保護作用及其機制。 方法：體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞,瞬時轉染pcDNA3.0-Sig-1R或Sig-1R siRNA質粒載體,再分別力入Cisplatin (10μmol/L)或生理鹽水(Saline)刺激24h。Sig-1R過表達分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R過表達、Cisplatin+Sig-1R過表達；Sig-1R干擾分組如下：Saline組、Cisplatin組、Saline+Sig-1R干擾組、Cisplatin+Sig-1R干擾組。應用real-time PCR和、western blot法檢測腎小管上皮細胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子α(peroxisome proliferator-activated receptor-y coactivator-la, PGC-la)和線粒體轉錄因子(mitochondrial transcription factor A, TFAM)的表達；熒光探針鈣黃綠素/AM檢測細胞MPTP孔開放情況；real-time PCR法檢測腎小管上皮細胞mtDNA拷貝數(shù)；熒光探針DCHFDA染料檢測細胞內ROS生成情況；JC-1染色結合流式細胞術檢測線粒體膜電位。體內實驗通過制備Sig-1R過表達轉基因小鼠,隨機分為4組：WT Saline組、WT Cisplatin組、Sig-1R transgenic Saline組、Sig-1Rtransgenic Cisplain組。腹腔注射Cisplatin (20mg/kg)構建順鉑急性腎損傷小鼠模型,同時對照組腹腔注射Saline。于腹腔注射后72h處死小鼠,檢測線粒體功能障礙的相關指標。 結果：(1)與Cisplatin組相比,Cisplatin+Sig-1R干擾組TFAM、PGC-1α表達分別下降49.7%和42.3%(均P0.05), ROS產(chǎn)生增加27.9%(P0.05), mtDNA拷貝數(shù)及線粒體膜電位分別下降17.5%和29.3%(均P0.05), MPTP孔開放增加。(2)過表達Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙,過表達Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導的TFAM、PGC-1α表達下降、mtDNA拷貝數(shù)及線粒體膜電位下降、ROS產(chǎn)生增加、MPTP孔開放。(3)體內實驗結果顯示,過表達Sig-1R可部分阻斷Cisplatin誘導的TFAM、PGC-1α表達下降、ntDNA拷貝數(shù)下降,提示Sig-1R過表達可部分抑制Cisplatin誘導的腎皮質線粒體功能障礙。 結論：Sig-1R通過抑制線粒體通透性轉換孔開放,部分阻斷線粒體功能障礙,從而減輕順鉑誘導腎小管上皮細胞損傷。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

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1 蘇維維;丁桂霞;朱春華;袁楊剛;張愛華;黃松明;;Sig-1R基因表達抑制對內質網(wǎng)應激和足細胞損傷的影響[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2011年05期

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本文編號：2118837