本文選題：維甲酸受體相關的孤兒受體　切入點：Th17細胞　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：維甲酸受體相關的孤兒受體(retinoic acid receptor-related orphan receptors,RORs)是一類配體依賴的轉錄因子,在生殖發(fā)育、生理節(jié)律調節(jié)、新陳代謝紊亂、炎癥發(fā)生以及免疫系統(tǒng)調節(jié)等一系列生理病理過程中扮演重要角色。RORs是核受體超家族中的一員,包括RORα、RORβ、RORγ三個亞型。RORα主要分布在肝臟、骨骼肌、皮膚、肺、脂肪組織、腎臟、胸腺、大腦和血液中,與肝糖原異生、脂代謝、動脈粥樣硬化等生理病理過程有關。RORβ主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,包括大腦、視網(wǎng)膜和松果腺,主要與脊髓、丘腦、小腦皮質對敏感信息的處理方面有關。RORγ高表達于胸腺中,在腎臟、肝臟、心臟、骨骼肌、脂肪組織、睪丸、前列腺、胰腺中也有分布,與類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化癥等自身免疫病有關。自身免疫病是一種與內分泌、環(huán)境、遺傳等因素有關的多因素疾病。目前,發(fā)病率約占世界人口的6%。自身免疫病正在威脅著人類的健康,且不易被治愈。Th17細胞與自身免疫病及某些炎癥性疾病有著密切的聯(lián)系。孤兒受體RORγ正因其可以影響Th17細胞的發(fā)育而受到廣泛關注。Th17細胞分泌的細胞炎癥因子白介素-17(interleukin,IL-17),可以引發(fā)炎癥或引起自身免疫病的發(fā)生。通過調節(jié)RORγ的活性,從而調節(jié)Th17細胞的分化和控制IL-17的分泌,進而得到治療效果。因此,RORγ在Th17細胞調節(jié)的疾病中是一個潛在的藥物靶標。孤兒受體因其內源性配體不明確而得名。最近的研究已報道了很多孤兒受體的合成配體。苯環(huán)酰胺類藥物T1317原本是肝X受體(LXR)的激動劑,后來Scripps研究所發(fā)現(xiàn)也可以作為RORγ的抑制劑。Scripps研究所、葛蘭素史克公司等研發(fā)部門已報道了若干RORγ的小分子抑制劑,包括SR1001、SR2211、SR1555、TMP778等。此外,天然產(chǎn)物地高辛及其衍生物、熊果酸等也是RORγ的選擇性小分子抑制劑。本論文旨在探尋針對RORγ為靶點的新型骨架小分子抑制劑。圍繞這一宗旨,做了如下工作:帶有6個組氨酸標簽的目的蛋白h RORγ-LBD野生型及其突變型h RORγ-LBD(C455E)以p ET24a為載體,在大腸桿菌原核系統(tǒng)中成功表達。經(jīng)鎳柱親和層析純化和分子篩層析純化,得到高純度的目的蛋白。野生型蛋白供結合能力測試實驗用,突變型蛋白供結晶實驗用。本論文通過基于結構的虛擬篩選和基于配體的虛擬篩選方法,從Chem Bridge化合物庫115萬個小分子中篩選得到28個候選化合物。通過高通量篩選Alpha Screen、TSA和Luciferase三種方法對28個候選化合物進行結合能力測試。其中,Alpha Screen實驗是測試配體小分子干擾蛋白RORγ-LBD與共招募因子相互作用的實驗;TSA實驗是測試配體小分子穩(wěn)定蛋白RORγ-LBD熱變性能力的實驗;Luciferase實驗是測試配體小分子對蛋白RORγ-LBD轉錄能力干擾的實驗。結果分析后得到具有改造潛力的N-苯基-2-(N-苯基苯基磺酰胺)乙酰胺骨架小分子C11(Alpha Screen實驗IC50:62.58μM;Luciferase實驗IC50:4.54μM;TSA實驗ΔTm:1.8oC)。為提高該類化合物的抑制活性,將化合物C11的結構進行優(yōu)化改造得到30個衍生物,其中抑制活性最好的3個衍生物為29、36、39。在蛋白水平上其抑制活性與化合物C11比較,分別提高約80倍、60倍和280倍,IC50結果分別是0.77μM,1.07μM和0.22μM。細胞水平選擇性實驗結果表明化合物36和39優(yōu)于29。綜合比較化合物36和39的活性,蛋白水平實驗表明化合物39(Alpha Screen實驗IC50:0.22μM)的抑制效果是化合物36的5倍(Alpha Screen實驗IC50:1.07μM)。最終選擇化合物39用于與蛋白h RORγ-LBD(C455E)復合物做共結晶實驗。晶體經(jīng)X射線衍射分辨率為3.0?,初步可見小分子與蛋白的結合模式。晶體結構仍在數(shù)據(jù)解析中。但是,若想完整地解釋復合物晶體的結合模式,還應將結晶條件進一步優(yōu)化。本論文實驗結果表明:發(fā)現(xiàn)N-苯基-2-(N-苯基苯基磺酰胺)乙酰胺骨架化合物可作為維甲酸受體相關的孤兒受體RORγ的一類新型抑制劑骨架。在這類化合物中39抑制效果顯著,且在細胞實驗上選擇性較好。其復合物晶體結構有助于小分子與蛋白相互作用關系的分析。化合物39是RORγ靶標的一個非常具有發(fā)展前景的小分子抑制劑。此化合物目前的研究進展為進一步研發(fā)此類化合物作為先導化合物,奠定了堅實基礎;為核受體小分子配體的探尋提供了新思路;為抗炎類藥物研發(fā)提供幫助。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943

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本文編號：1623386