本文關(guān)鍵詞： 佐劑性關(guān)節(jié)炎 MiR-152 DNMT1 MeCP2 Wnt信號　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫異常的、系統(tǒng)性多關(guān)節(jié)性疾病,成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA病理機制中起關(guān)鍵作用。Wnt信號影響RA病理機制,對RA病理發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Masala等研究發(fā)現(xiàn)在脊髓發(fā)育不良的髓細胞,分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(Secreted Frizzled-Related Protein4, SFRP4)發(fā)生表觀遺傳學(xué)修飾致其表達降低,誘發(fā)Wnt信號激活。在RA病理變化中,是否也存在SFRP4表達變化,Wnt信號影響RA的病理變化是否與SFRP4有關(guān)?佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis, AA)具有與RA相似的病理學(xué)、免疫學(xué)特點,是理想的RA動物模型。本實驗采用AA大鼠作為RA研究動物模型,研究SFRP4在對照組大鼠和AA大鼠滑膜中的表達變化,及其對Wnt信號的影響,深入研究在AA病理中SFRP4基因發(fā)生的表觀遺傳學(xué)修飾,揭示甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein2, MeCP2)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1, DNMT1)對SFRP4表達的影響,以及microRNA(miR)-152在其中發(fā)揮的重要作用,為RA的研究與防治提供新的思路。研究內(nèi)容主要包括以下五個部分： 1. SFRP4在AA大鼠滑膜中的表達,及其與Wnt信號的關(guān)系。 免疫組化、RT-PCR和Western blotting檢測SFRP4在對照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達變化,分離培養(yǎng)對照大鼠和AA大鼠FLS, RT-PCR和Western blotting檢測SFRP4在對照大鼠和AA大鼠FLS中的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比,SFRP4在AA大鼠滑膜組織和FLS中表達均顯著降低,提示異常表達的SFRP4可能對AA病理機制發(fā)揮調(diào)控作用。為了研究SFRP4在AA大鼠中對Wnt信號的調(diào)控作用,分離培養(yǎng)對照大鼠滑膜FLS,培養(yǎng)液中加入SFRP4抗體,采用real time qPCR和Western blotting檢鋇SFRP4抗體對對照大鼠FLS Wnt信號通路關(guān)鍵基因β-catenin表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SFRP4抗體顯著上調(diào)對照大鼠FLS的β-catenin表達。為進一步驗證SFRP4對Wnt信號的影響,AA大鼠FLS培養(yǎng)液中加入重組SFRP4蛋白,Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)重組SFRP4蛋白能顯著抑制AA大鼠FLS的β-catenin、fibronectin表達。提示SFRP4可能通過抑制Wnt信號影響AA病理變化。 2.DNA甲基化特異性抑制劑(5-aza-2'-deoxycytidine,5-azadC)對AA大鼠SFRP4表達的影響。 采用RT-PCR、Western blotting、MTT等實驗方法檢測5-azadC刺激AA大鼠FLS對SFRP4表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5μM,5.0μM,7.5μM劑量的5-azadC分別刺激AA大鼠FLS均能顯著上調(diào)SFRP4表達,5μM5-azadC分別刺激培養(yǎng)AA大鼠FLS24、48、72h后SFRP4表達均顯著升高,提示AA病理中SFRP4基因可能發(fā)生了DNA甲基化修飾致其表達降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能顯著抑制經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵基因β-catenin、ccndl表達。同時5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能顯著抑制fibronectin表達和AA大鼠FLS增殖。上述結(jié)果綜合提示,AA病理中SFRP4低表達可能與SFRP4基因發(fā)生了DNA甲基化修飾有關(guān),而5-azadC能上調(diào)SFRP4表達,進而能抑制β-catenin、ccnd1、fibronectin表達,表明SFRP4可能通過Wnt信號通路影響AA病理變化。 3. MeCP2對AA大鼠SFRP4表達的影響 采用RT-PCR和Western blotting檢測MeCP2在對照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比,MeCP2在AA大鼠滑膜組織中表達顯著升高,RT-PCR和Western blotting檢測進一步發(fā)現(xiàn),在AA大鼠FLS中,MeCP2表達顯著高于對照。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siMeCP2至AA大鼠FLS,研究MeCP2表達抑制對SFRP4表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeCP2表達抑制后,SFRP4表達顯著升高。以上實驗結(jié)果提示,AA病理中異常高表達的MeCP2可能與抑制SFRP4表達有關(guān)。 4. DNMT1對AA大鼠SFRP4表達的影響 Real time qPCR和Western blotting檢測DNMT1在對照大鼠和AA大鼠滑膜組織中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比,在AA大鼠滑膜組織中DNMT1表達顯著上調(diào),real time qPCR和Western blotting檢測進一步發(fā)現(xiàn)DNMT1在AA大鼠FLS中的表達顯著高于對照,DNMT1表達抑制后SFRP4表達顯著升高。以上實驗結(jié)果提示,AA病理中異常高表達的DNMT1可能與SFRP4表達下調(diào)有關(guān)。 5.MiR-152對AA大鼠SFRP4的作用及信號通路 采用real time qPCR、Western blotting、MTT等方法檢測miR-152在對照大鼠和AA大鼠中的表達差異及其對DNMT1表達的影響,進一步研究過表達的miR-152對SFRP4表達的影響,對Wnt信號的影響和對AA的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-152在AA大鼠中表達顯著下調(diào),過表達的miR-152抑制DNMT1的表達,上調(diào)SFRP4的表達,抑制經(jīng)典Wnt信號,抑制AA大鼠FLS異常增殖。以上實驗結(jié)果提示,miR-152具有抑制AA的作用,并且這種抑制作用可能是通過對DNMT1表達的抑制和對Wnt信號的抑制實現(xiàn)的。 綜上所述,在AA大鼠中SFRP4基因可能發(fā)生表觀遺傳學(xué)修飾致其表達降低,進而引發(fā)Wnt信號激活,促進AA的發(fā)生發(fā)展。在AA大鼠中高表達的DNMT1和MeCP2可能抑制SFRP4表達,而低表達的miR-152可能與DNMT1的高表達相關(guān),DNMT1, MeCP2和miR-152對AA大鼠SFRP4低表達發(fā)揮重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻】

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本文編號：1510654