【摘要】 桑白皮(Cortex Mori)是�？粕僦参颩orus alba L的干燥根皮。為中國藥典收載的常用中藥之一,具有瀉肺平喘、利水消腫功效�，F(xiàn)代藥理研究表明,桑白皮降糖降脂主要藥效成分為桑白皮黃酮、生物堿及多糖類成分。本課題選用桑白皮進行研究,以期進一步揭示桑白皮藥理作用物質(zhì)基礎(chǔ),為有效部位的研究和新制劑的開發(fā)提供方法與依據(jù)。本文在綜述了桑白皮國內(nèi)外研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上,進行了桑白皮的質(zhì)量控制；桑白皮有效部位的提取純化工藝；桑白皮有效部位的質(zhì)控及初步藥效研究。1.桑白皮的含量測定研究采用紫外分光光度法和高效液相法,以桑根酮C、D、DNJ、葡萄糖為對照,測定提取物中總黃酮、總生物堿、總多糖、桑根酮C、D、DNJ的含量。2.桑白皮提取純化工藝的研究本研究優(yōu)化了桑白皮黃酮、生物堿及多糖的同步提取工藝,通過單因素考察,確立了最佳的提取工藝。純化工藝在串聯(lián)的高壓大孔樹脂和離子交換樹脂的基礎(chǔ)上,采用同步提取、稀醇上樣及分別洗脫對桑白皮總黃酮、總生物堿及總多糖進行精制純化。通過對各個影響因素的考察,得到最佳的純化工藝：將高壓PIPO-01大孔樹脂和001×7型陽離子交換樹脂柱串聯(lián),原藥液經(jīng)濃縮后,上樣液濃度為0.12g/mL,上樣量(樹脂與上樣藥材量比值)為1倍量,8BV水洗脫后,分別用8BV80%乙醇洗脫大孔樹脂柱,6BV0.5moL/L氨水洗脫離子交換樹脂柱。收集70%乙醇部分,減壓濃縮至干,真空干燥,得到的各有效部位的純度在50.0%以上。3.桑白皮有效部位質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究經(jīng)過對桑白皮有效部位的提取、純化,初步建立了以桑根酮D、DNJ及葡萄糖為對照品的桑白皮有效部位TLC鑒別方法；并建立了桑白皮總黃酮、總生物堿及總多糖UV含量測定方法和桑根酮C、D、DNJ的HPLC法含量測定方法,初步建立有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。4.桑白皮藥材不同部位降血糖初步研究采用高脂飼料和STZ誘導(dǎo)小鼠形成2型糖尿病模型的方法,對桑白皮不同部位的降糖藥理作用進行了初步探討,結(jié)果表明有效部位具有一定的降血糖作用。 

引 言

桑白皮（Cortex Mori)是桑科桑屬植物Morus alba L.的干燥根皮。性甘微苦、寒，歸肺經(jīng)，具有灣肺平喘、利水消腫功能，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚浮腫。民間常用于消炎、利尿、解熱、鎮(zhèn)咳、怯痰等。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代本草均有收載�！侗静菥V目》載：桑白皮主治消渴尿多；南北朝劉宋《雷公炮灸論》認(rèn)為桑白皮在中藥中有獨特效用，“是它藥不替也”�，F(xiàn)代研究表明桑白皮中含有黃酮、生物堿、多糖、香豆素、糖蛋白、揮發(fā)油等。藥理研宄表明桑白皮具有降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗病毒等作用。

迄今為止，國內(nèi)外文獻報道的多是桑白皮化學(xué)成分的提取分離，或提取物、化學(xué)成分的藥理研究，制劑及其臨床應(yīng)用方面不多，質(zhì)量控制方面的研宄較少，2010年版藥典中規(guī)定了桑白皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但僅收載了一項薄層鑒別，沒有含量測定項。對于桑白皮提取物，目前仍未有文獻來規(guī)定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所以需要制定一個比較完善的桑白皮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
中草藥化學(xué)成分提取分離技術(shù)發(fā)展日新月異，中藥有效部位和有效單體的開發(fā)也越來越受重視。而中藥提取分離制備方法的研究，為進一步探討中藥質(zhì)量、提高制劑生產(chǎn)、中藥的治病機制水平、提高臨床療效提供了前提，也是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。前人研究較多的是桑白皮中生物堿類成分，特別是DNJ分離純化以及其對a -糖苷酶抑制作用的研宄，對桑白皮中異戊煉基黃酮及多糖成分研究較少。本研宄旨在建立一種簡便、經(jīng)濟的方法同時提取分離得到桑白皮的多種活性成分。
采用大孔吸附樹脂從中藥及其復(fù)方中有選擇性地吸附其中的有效部分，去除無效部分的提取精制分離技術(shù)己較廣泛地應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離，特別是用于黃酮類物質(zhì)的提取分離。通過陽離子交換樹脂離子交換作用，與提取液中生物堿陽離子發(fā)生交換吸附，富集純化桑白皮中含量較低的生物堿類成分，同時將其與多糖類成分有效的分離幵來。本文釆用高壓柱將兩種樹脂柱串聯(lián)，實現(xiàn)了較常壓柱子更快捷、方便的連續(xù)分離的方法，提取后的濃縮液依次經(jīng)過大孔樹脂和陽離子樹脂，可以同時分離得到黃酮類、多糖類和生物堿類組份。
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第一章研究概況

第一節(jié)桑白皮研究概況
桑白皮(^Cortex Mori)是�？粕僦参颩orus alba L的干燥根皮。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代本草均有收載。桑白皮性甘微苦、寒，歸肺經(jīng)，具有灣肺平喘、利水消腫功能，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚浮腫[']。民間常用于消炎、利尿、解熱、鎮(zhèn)咳、祛痰等。
1.1桑白皮化學(xué)成分
曰本學(xué)者Nomura T.在20世紀(jì)80年代初領(lǐng)導(dǎo)的研宄小組對桑白皮alba L )化學(xué)成分進行了系統(tǒng)的研宄，從中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的Diels-Alder型加合物。迄今為止，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)從桑屬植物中得到百余種新化合物，主要包括異戊稀基黃酮類化合物、Diels-Alder型加合物、多經(jīng)基生物堿和苗類化合物等。另外，還含有多糖、三蔽、留體、氨基酸和香豆素等化合物。
1.1.1異戊稀基黃酮類成分
異戊稀基黃酮化合物是一大類分布于�？�、豆科和菊科等少數(shù)幾個科的植物中的天然產(chǎn)物，具有非常明顯的化學(xué)分類學(xué)特征。它們以多方面的生理活性及獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)引起了國內(nèi)外藥學(xué)家的廣泛興趣，異戊稀基黃酮化合物被認(rèn)為是作為植物防衛(wèi)素，在植物抵御外來生物的侵襲過程中，它會發(fā)揮重要的植物生理調(diào)節(jié)作用。
研究表明，異戊稀基黃酮類化合物具有多種生物活性，例如，降血壓、抗真菌、抗病菌、抗氧化、抗HIV、抗腫瘤等[2”"；黃酮類化合物至少要求有酸經(jīng)基和一定的親脂性才認(rèn)為有生物活性(尤其是抗微生物的活性)的，學(xué)術(shù)界普遍這樣認(rèn)為。據(jù)NikaidoT.等報道，異戊稀基的存在，使得黃酮類化合物中親脂性極大的增長，強烈的親和生物膜性，進而使得相關(guān)生物活性顯著提高["]。由于異戊稀基黃酮類化合物在藥理研宄中表現(xiàn)出多種明顯的活性，從20世紀(jì)70年代開始，對該類成分的研究也愈來愈引起人們的關(guān)注。迄今為止，天然由來的該類化合物已有上千余種。
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第二節(jié)2型糖尿病研究概況
2.1糖尿病簡介
糖尿�。―iabetes mellitus)通常是指2型糖尿�。═ype 2 Diabetes mellitus)。糖尿病可分為1型和2型。1型糖尿病是指：病人胰島B細(xì)胞破壞，引起胰島素絕對缺乏，有酮癥酸中毒傾向的糖尿病。2型糖尿病是指：以胰島素抵抗為主伴胰島素分泌不足，或胰島素分泌不足為主伴或不伴胰島素抵抗的糖尿病。通常所說的糖尿病通常指2型糖尿病，占DM總數(shù)的90%以上[_]。一般意義上認(rèn)為糖尿病表現(xiàn)為“三多一少”癥狀，即多飲、多食、多尿、體重減少。但是，II型糖尿病有90%是肥胖者，糖尿病患病率與肥胖的流行、靜態(tài)生活方式有關(guān)，而且與年齡增加呈正相關(guān)
。
糖尿病除了自身糖代謝紊亂所帶了的危害外，其長期的高血糖還可累及各組織器官而引起一系列大血管及微血管并發(fā)癥（如心腦血管疾病、腎病變、神經(jīng)病變等）_，其對人體的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了糖尿病本身，在糖尿病患者中，70%的住院費用是用于糖尿病慢性并發(fā)癥的治療，所以糖尿病又被稱為“百病之源”。在這其中，糖尿病所帶來的最直接的危害體現(xiàn)在其對心臟病變的影響。糖尿病心臟病變（DiabeticCardiopathy)臨床指糖尿病并發(fā)或伴發(fā)的心臟病，包括動脈粥樣硬化心臟病、糖尿病性心肌病及糖尿病自主神經(jīng)病變_。心臟病變被稱為是糖尿病最嚴(yán)重而突出的問題，約占糖尿病患者死亡原因的80%，其中70%死于糖尿病性冠心病。2004年美國國家膽固醇教育規(guī)劃發(fā)表的第三個成人治療計劃（NCEP ATP III)提出，糖尿病患者10年內(nèi)發(fā)生冠脈事件的風(fēng)險很高，并將糖尿病列為“冠心�。–HD)的等危癥” [95]。據(jù)世界衛(wèi)生組織相關(guān)研宄資料統(tǒng)計，1997年糖尿病患者約1.3億，預(yù)計到2025年全球糖尿病患者總數(shù)可能達到3億人。中國是目前糖尿病患者最多的國家之一，糖尿病患病率呈日益增長趨勢。因此對2型糖尿病發(fā)病機制以及生物祀點的研宄是糖尿病治療的關(guān)鍵，并成為糖尿病領(lǐng)域的科研熱點及難題。
目前研宄認(rèn)為，胰島素抵抗和P細(xì)胞胰島素分泌缺陷是2型糖尿病發(fā)病的兩個主要環(huán)節(jié)。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病環(huán)節(jié)中的重要組成部分，其發(fā)生發(fā)展過程貫穿于2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中，也是糖尿病早期和主要表現(xiàn)。
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第二章 桑白皮黃酮、生物堿及多糖測定方法研究 ...............21-34 
1.1 儀器與材料 ...........................21 
1.2 方法與結(jié)果 ...................21-32 
1.2.1 總黃酮含量測定................. 21-24 
1.2.2 桑根酮C、D含量測定................. 24-27 
1.2.3 總生物堿含量測定.............. 27-28 
1.2.4 1-脫氧野尻霉素(DNJ)含量測定 .............28-30 
1.2.5 總多糖含量測定 ......................30-32 
1.3 討論............................. 32-34 
第三章 桑白皮有效部位的同步高效提取純化工藝研究 ..................34-51 
第一節(jié) 桑白皮有效部位的同步高效提取工藝研究.............. 34-39 
1.1 儀器與材料 ............................34 
1.2 方法與結(jié)果 .................34-38 
1.3 討論 ......................38-39 
第二節(jié) 桑白皮有效部位的同步高效純化工藝研究 .................39-49 
2.1 儀器與材料 ...............................39-40 
2.2 方法與結(jié)果 ....................40-48 
2.3 .........................討論 48-49 
第三節(jié) 桑白皮有效部位的同步高效提取純化工藝中試放大研究...................... 49-51 
3.1 儀器與材料 ...........................49 
3.2 方法與結(jié)果 ...............49-50 
3.3 討論................................ 50-51 
第四章 桑白皮有效部位質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 ...................51-68

第五章 桑白皮不同部位對2型糖尿病小鼠降糖藥理作用的研究

本實驗以高脂詞料加鏈脲佐菌素（STZ)誘導(dǎo)C57小鼠模型，來探討桑白皮不同部位對高脂飼料加鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠血糖、血脂、低密度脂蛋白、胰島素的影響，并對其降糖作用機制進行初步探討。
1. 1試驗材料
1.1. 1動物
5周齡雄性C57BL/6N小鼠，體重（19±2) g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，醫(yī)學(xué)實驗動物合格證號為SCXR (京）2012-0001。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，飼養(yǎng)溫度與濕度：20-25°C、40-70%。采用12h:12h晝夜間斷照明，筆耕文化傳播，動物自由進食、飲水。
1.1.2詞料
基礎(chǔ)飼料、高脂飼料均由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。高脂飼料配方組成：酷蛋白26.17%，L-胱氨酸0.39%,麥芽糖糊精16. 35%，鹿糖9. 00%，纖維素6. 54%，豆油，3. 27%,豬油 32. 06%,礦物質(zhì) AIN-93 4. 58%,維生素 AIN-93 1. 31%,氯化膽堿 0. 33%，膽固醇1. 0%,膽鹽0. 15%,合格證號為SCXK(粵)2008-0002。
1.1. 3試劑
桑白皮不同部位，總黃酮、總生物堿及總多糖是將桑白皮經(jīng)60%醇提后，適當(dāng)濃縮，上串聯(lián)大孔樹脂及離子交換樹脂得到，（由本實驗室提供）�？傸S酮含量為60% (以桑根酮C計）；總生物堿含量為50% (以1-脫氧野尻霉素DNJ計）；總多糖含量為50%(以葡萄糖計）。
STZ (Sigma,批號：040M1367), 二甲雙胍（AladdinChemistry，批號：23195)，肝素鈉（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32020612),葡萄糖氧化試劑盒；甘油三酷試劑盒；總膽固醇試劑盒；低密度脂蛋白試劑盒；總膽紅素；尿酸（上述試劑盒均有上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號分別為：20120801; 20121002； 20120801;20120701； 20121201; 20121201)； 11 0 -類固醇脫氧酶試劑盒（美國R & D，批號分別為：DRE68753; DRE84576)；梓檬酸、梓檬酸鈉均為分析純。
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結(jié)語

本文通過查閱國內(nèi)外文獻，并詳細(xì)分析桑白皮的中醫(yī)藥理論闡述、藥學(xué)、藥理藥效及臨床等方面的內(nèi)容，進行了一系列的藥學(xué)藥理學(xué)實驗研究。
1.1桑白皮含量測定方法旳建立
建立了桑白皮總黃酮、總生物堿及總多糖含量測定方法。其中桑白皮總黃酮含量測定方法中與常用總黃酮含量測定的兩種顯色方法進行比較，并詳細(xì)考察鹽酸-鎂粉顯色法。不足之處是沒有對總生物堿和總多糖含量測定方法做更深入的考察。
釆用HPLC-UV方法，經(jīng)色譜條件優(yōu)化，實現(xiàn)了桑白皮藥效成分桑根酮C、D及DNJ含量測定，為控制桑白皮及含有桑白皮的中成藥的質(zhì)量提供方法和依據(jù)。
1.2桑白皮有效部位的同步高效提取純化工藝
以桑白皮中總黃酮、DNJ及總多糖的含量為指標(biāo)，采用單因素考察優(yōu)化了提取工藝。以大孔樹脂、離子交換樹脂富集、純化桑白皮中總黃酮、總生物堿及總多糖對上樣量、洗脫用醇濃度、氨水濃度和用量等進行工藝考察�？疾焖霉に噮�(shù)經(jīng)重復(fù)，證明方法穩(wěn)定可行。
此工藝的創(chuàng)新之處是實現(xiàn)了桑白皮三個有效部位的同步高效提取，稀醇上樣解決了桑白皮異戊稀基黃酮上樣難的問題，串聯(lián)樹脂柱分別洗脫得到三個有效部位。
1.3桑白皮有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
桑白皮有效部位在2010年版中國藥典的基礎(chǔ)上，做了薄層定性鑒別和總黃酮、總生物堿及總多糖、桑根酮C、D及DNJ含量測定，測定方法重復(fù)性強，穩(wěn)定可行。為桑白皮有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供方法和依據(jù)。不足之處是生物堿的薄層定性鑒別沒有找到合適的展開系統(tǒng)及顯色劑。
1.4桑白皮不同部位的降血糖藥理作用的研究
本文中采用高脂飼料+STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病C57小鼠模型，對桑白皮不同部位的降血糖作用進行了初步探討，結(jié)果表明桑白皮3個部位對2型糖尿病小鼠血糖均有一定的控制作用，其中異戊稀基黃酮類及生物堿成分降糖降脂作用效果較為明顯，異戊稀基黃酮類成分對于高脂飼料誘導(dǎo)的高血脂小鼠體重有明顯抑制作用，而且黃酮類成分能夠降低低密度脂蛋白作用。進一步對桑白皮不同部位降糖作用機制做了初步探討發(fā)現(xiàn)，實驗結(jié)果不能證明桑白皮不同部位降糖作用是通過抑制肺中11 e-HSDl的水平，有待于進一步的研究。
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本文編號：11045