發(fā)布時間：2017-10-22 00:07

  本文關鍵詞：EGFR受體介導肺腫瘤靶向siRNA脂多胺修飾脂質體的體內動態(tài)與藥效學評價

  更多相關文章： EGFR受體 survivin-siRNA MRP1-siRNA 荷正電類脂質 肺部吸入

【摘要】：目的：構建EGFR受體介導肺腫瘤靶向survivin siRNA和MRP1 siRNA共負載脂多胺修飾脂質體(EGFR-PEG-NCLs-siRNA),評價其制劑學性質、細胞內動態(tài)、體內組織分布以及與順鉑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果。方法：首先,通過置換和酰胺化反應合成類脂質陽離子載體材料N,N'-二油酰三羥甲基氨基甲烷(2-氨基乙基)胺(N,N'-dioleoyl tris (2-aminoethyl) amine, NDOA),并合成聚乙二醇(PEG)馬來酸嫁接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DEPE)。通過硅膠薄層色譜法(TLC)、傅里葉紅外光譜法(FT-IR)和核磁共振法(1H-NMR)等對上述合成產物進行結構驗證。采用乙醇注入法制備陽離子脂質體,并測定其粒徑,Zeta電位和FAM-siRNA的包封率。以人源非小細胞肺腺癌A549細胞和耐順鉑株A549/DDP細胞為模型,以MTT法考察空白長循環(huán)陽離子脂質體(PEG-NCLs)對A549與A549/DDP細胞的安全性。采用流式細胞儀(Flow Cytometry, FCM)和激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope, CLSM)考察A549/DDP細胞對EGFR-PEG-NCLs的攝取及其從A549/DDP細胞溶酶體中的逃逸。采用FCM考察EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA對A549/DDP細胞的凋亡。采用熒光實時定量PCR(RT-PCR)考察EGFR-PEG-NCLs-survivin/MRP1 siRNA對A549細胞的基因沉默。噴霧冷凍干燥法將脂質體制成微粉供肺部干粉吸入給藥。以帶綠色熒光的人源性肺腺癌細胞株Luc-A549建立裸鼠原位肺癌模型,用小動物活體成像儀考察負載siRNA的脂質體通過肺部吸入與尾靜脈注射給藥時在體內各組織器官分布情況；并考察負載survivin siRNA和MRP1 siRNA的脂質體與順鉑聯(lián)用時抑制腫瘤生長的效果。最后,通過蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin staining, HE)考察給藥對各組織器官的影響。結果：經TLC,1H-NMR和FT-IR法驗證了陽離子載體材料NDOA的成功制備,其純度為87%；DSPE-PEG2000-Mal經TLC和1H-NMR法驗證產物合成,其純度為86.2%。PEG-NCLs的粒徑為(193.2±3.4)nm,Zeta-電位為(7.9 ± 0.1)mV, FAM-siRNA的包封率為(91.9±0.8)%。TEM圖結果顯示,所制得脂質體粒度均勻,顆粒圓整,分散性良好。攝取結果表明,EGFR靶向可以明顯提高A549/DDP細胞對PEG-NCLs的攝取能力,其攝取能力是未經EGFR修飾的1.4倍。CLSM結果顯示,EGFR-PEG-NCLs-siRNA可從A549/DDP細胞的溶酶體中成功逃逸EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA組的凋亡率為(41.14±1.68)%,約為Lipofectamine-2000組(19.86±1.30)%的2倍。EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA的基因沉默率為(96.7±1.2)%,EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA的基因沉默率為(50.0±16.1)%,均有良好的基因沉默效果。此外,EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA和EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA轉染進A549細胞后,A549細胞對順鉑的敏感性提高。體內組織分布結果顯示,脂質體通過肺部吸入相對于尾靜脈注射在肺部停留時間久,并且靶向性較好。抑瘤實驗結果表明,順鉑(DDP)與EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA與EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA聯(lián)合給藥具有明顯的抑制腫瘤生長的作用。HE染色結果表明,DDP與EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA與EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA聯(lián)合給藥對腫瘤的殺傷能力最強,且不會對各組織器官造成損傷,安全性較好。結論：本文制備的EGFR受體介導肺腫瘤靶向siRNA脂多修飾脂質體(EGFR-PEG-NCLs-siRNA)粒徑均一,顆粒圓整,分散性和穩(wěn)定性較好,EGFR靶向顯著提高細胞攝取率,并且可以成功的從溶酶體中逃逸出來。它能很好地轉運siRNA,與順鉑聯(lián)合用藥可以發(fā)揮良好的體內外殺傷非小細胞肺癌A549細胞作用。
【關鍵詞】：EGFR受體 survivin-siRNA MRP1-siRNA 荷正電類脂質 肺部吸入
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻綜述12-19
• 1 RNA干擾12-14
• 1.1 RNA干擾的起源12
• 1.2 siRNA在肺部遞送的障礙12-14
• 2 SIRNA在治療肺部疾病的給藥途徑14-15
• 3 肺部疾病模型15-16
• 4 臨床研究進展16-17
• 5 展望17
• 6 本研究的立題依據(jù)和目的17-19
• 第二章 陽離子脂質材料NDOA的合成及表征19-28
• 1 實驗材料和儀器19-20
• 1.1 實驗材料19
• 1.2 實驗儀器19-20
• 2 實驗方法20-22
• 2.1 NDOA的合成20-21
• 2.2 DSPE-PEG_(2000)-Mal的合成21-22
• 3 實驗結果與討論22-27
• 3.1 油酸三氟乙酯的表征22-24
• 3.2 NDOA的表征24-26
• 3.3 DSPE-PEG_(2000)-Mal的表征26-27
• 4 本章小結27-28
• 第三章 EGFR受體介導肺腫瘤靶向siRNA脂質體的制備28-34
• 1 實驗材料和儀器28-29
• 1.1 實驗材料28
• 1.2 實驗儀器28-29
• 2 溶液配制29
• 3 實驗方法29-31
• 3.1 FAM-siRNA標準曲線的繪制29
• 3.2 PEG修飾的陽離子脂質體的制備29
• 3.3 Anti-EGFR mAb的巰基化29-30
• 3.4 EGFR靶向負載siRNA的脂質體的制備30
• 3.5 粒徑及電位的測定30
• 3.6 脂質體的表征30
• 3.7 包封率的測定30
• 3.8 負載siRNA脂質體的N/P30-31
• 4 實驗結果與討論31-33
• 4.1 FAM-siRNA的標準曲線31
• 4.2 脂質體的制備與表征31-33
• 5 本章小結33-34
• 第四章 陽離子脂質體細胞攝取、定位及藥效學評價34-50
• 1 實驗材料和儀器34-35
• 1.1 實驗材料34-35
• 1.2 實驗儀器35
• 2 溶液配制35
• 3 實驗方法35-39
• 3.1 細胞培養(yǎng)35
• 3.2 細胞毒性35-36
• 3.3 細胞攝取36-37
• 3.4 溶酶體逃逸37
• 3.5 細胞凋亡37
• 3.6 RT-PCR檢測survivin基因和MRP1基因mRNA的表達37-38
• 3.7 體外藥效學評價38-39
• 3.8 數(shù)據(jù)的分析39
• 4 實驗結果39-49
• 4.1 細胞毒性39-40
• 4.2 細胞攝取40-42
• 4.3 溶酶體逃逸42-43
• 4.5 細胞凋亡43-45
• 4.6 RT-PCR測定survivin基因和MRP1基因中mRNA的表達45-46
• 4.7 細胞藥效學評價46-49
• 5 本章小結49-50
• 第五章 EGFR-PEG-NCLS-ICG干粉吸入劑的制備與評價50-56
• 1 實驗材料與儀器50
• 1.1 實驗材料50
• 1.2 實驗儀器50
• 2 實驗方法50-52
• 2.1 EGFR-PEG-NCLs-ICG干粉吸入劑的制備50-51
• 2.2 粉末形態(tài)51
• 2.3 X-射線衍射51
• 2.4 引濕性51
• 2.5 排空率51
• 2.6 體內組織分布51-52
• 3 實驗結果與討論52-55
• 3.1 微粉的粒度分布52
• 3.2 粉末形態(tài)52-53
• 3.3 X-射線衍射53-54
• 3.4 排空率54
• 3.5 引濕性54-55
• 3.6 體內組織分布55
• 4. 本章小結55-56
• 第六章 EGFR受體介導肺腫瘤靶向siRNA脂多胺修飾脂質體的體內評價56-65
• 1 實驗材料與儀器56-57
• 1.1 實驗材料56
• 1.2 實驗儀器56-57
• 1.3 實驗動物57
• 2 溶液配制57
• 3 實驗方法57-58
• 3.1 肺癌原位模型的建立57
• 3.2 肺癌原位模型的活體熒光成像57
• 3.3 肺癌原位模型離體器官成像及組織分布研究57-58
• 3.4 體內藥效學評價58
• 3.5 離體組織H&E染色58
• 3.6 數(shù)據(jù)的分析58
• 4 實驗結果與討論58-64
• 4.1 近紅外熒光成像58-60
• 4.2 離體組織分布60-62
• 4.3 抗腫瘤效果62-63
• 4.4 離體組織H&E染色63-64
• 5 小結64-65
• 全文總結65-66
• 參考文獻66-73
• 致謝73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 秦宏陽;羅玉均;張得玉;馮春復;何逸民;張桂紅;;2型豬圓環(huán)病毒感染對小鼠組織中Caspase3、Bak及Bcl-2基因表達的影響[J];中國預防獸醫(yī)學報;2009年05期

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本文編號：1075845