【摘要】： 各種原因?qū)е碌母嗡ソ呤殖Ｒ?內(nèi)科綜合治療療效差。人工肝支持系統(tǒng)是治療肝衰竭的重要方法之一,以培養(yǎng)肝細(xì)胞為核心的生物人工肝可暫時(shí)替代肝臟功能,清除有害物質(zhì),補(bǔ)充生物活性物質(zhì)。目前用于臨床研究的肝細(xì)胞材料主要有豬肝細(xì)胞、從HepG2細(xì)胞獲得的C3A細(xì)胞系。采用C3A細(xì)胞的ELAD生物人工肝臨床研究顯示對(duì)肝衰竭患者有一定療效,但治療過程中有出血、過敏、凝血等不良反應(yīng)。為完善肝細(xì)胞的功能,本課題將人肝再生增強(qiáng)因子(hALR)應(yīng)用于生物人工肝細(xì)胞材料中,構(gòu)建體外生物人工肝支持系統(tǒng)(BLASS),以期增強(qiáng)肝細(xì)胞分泌肝再生增強(qiáng)因子的能力,提高生物人工肝的療效。 1.pcDNA3.1(-)hALR重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定ALR是一種熱穩(wěn)定細(xì)胞因子,它能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和肝臟再生、抑制NK細(xì)胞活性,對(duì)受損的肝細(xì)胞具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。本試驗(yàn)從肝組織中提取RNA,RT-PCR擴(kuò)增出hALR片段,克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-),構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)hALR,經(jīng)測序、雙酶切等方法鑒定,符合應(yīng)用要求。 2.hALR肝細(xì)胞系的建立及功能評(píng)價(jià)采用有限稀釋法和利多卡因轉(zhuǎn)化等方法篩選HepG2細(xì)胞,挑選出一株生長旺盛、有一定利多卡因代謝功能的細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)hALR,經(jīng)G418篩選,在體外培養(yǎng)50代后,進(jìn)一步對(duì)其合成、代謝、解毒等功能評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:該細(xì)胞系功能穩(wěn)定,形態(tài)良好,生長旺盛,24h利多卡因轉(zhuǎn)化率65%,安定轉(zhuǎn)化率79.33%。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)hALR在肝細(xì)胞胞漿中大量存在。轉(zhuǎn)染后的肝細(xì)胞生長速度、白蛋白合成能力等均較轉(zhuǎn)染hALR之前肝細(xì)胞有所增強(qiáng)。培養(yǎng)72h后,肝細(xì)胞上清液中AFP可升高至118.0±56ng/ml。免疫斑點(diǎn)印跡法檢測到其培養(yǎng)上清液中ALR蛋白水平升高。另外該肝細(xì)胞系可在體外大量、快速增殖,基本符合生物人工肝細(xì)胞材料的要求。 3.hALR肝細(xì)胞系的生物反應(yīng)器培養(yǎng)用已建立的hALR肝細(xì)胞系為細(xì)胞材料,以費(fèi)森尤斯公司的P2S血漿濾過器為中空纖維反應(yīng)器,反應(yīng)器中預(yù)先裝入存活率95%以上、總量1×10~8個(gè)肝細(xì)胞。用管路連接蠕動(dòng)泵、肝細(xì)胞培養(yǎng)液等,構(gòu)建生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)系統(tǒng),對(duì)肝細(xì)胞在反應(yīng)器中的生長及功能進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)保持完整,并有一定的合成白蛋白、甲胎蛋白、尿素氮等作用。培養(yǎng)72h后細(xì)胞數(shù)升至7.60×10~8,96h后為9.02×10~8,細(xì)胞存活率分別為92%和95%,在倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察下可見細(xì)胞能較好粘附在中空纖維上。24h利多卡因轉(zhuǎn)化率88.4%,細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)菌和支原體檢測均未發(fā)現(xiàn)異常。 4.離線型生物人工肝支持系統(tǒng)的構(gòu)建及對(duì)肝衰竭患者血漿體外治療的初步研究我們采用“離線”方法,在體外對(duì)血漿置換后廢棄血漿進(jìn)行膽紅素吸附,然后采用血漿代替培養(yǎng)液,對(duì)生物反應(yīng)器中hALR肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),充分利用肝細(xì)胞的代謝、解毒和合成功能。結(jié)果顯示:治療前血漿TBil為332.22±22.54umol/L,膽紅素吸附后TBil為295.6±128.7μmol/L(P＜0.01),白蛋白、BUN、血糖等變化無顯著性差異。離線生物人工肝治療前血漿中TBil、AFP和白蛋白值分別是295.6±128.7μmol/L,21.2±17.5ng/ml和26.44±2.186g/L,經(jīng)4～6h治療后,上述指標(biāo)分別為239.4±103.9μmol/L(P＜0.05),102±62.8ng/ml(P＜0.01)和32.44±2.29g/L(P＜0.05)。結(jié)果提示本離線型生物人工肝支持系統(tǒng)具有降低膽紅素,增加白蛋白、尿素、AFP的合成等作用。 本項(xiàng)目成功構(gòu)建hALR重組質(zhì)粒,篩選出表達(dá)hALR的肝細(xì)胞系,并構(gòu)建生物反應(yīng)器及離線式生物人工肝支持系統(tǒng),對(duì)肝衰竭患者血漿進(jìn)行研究。本研究可簡化生物人工肝制備的難度和方法,減少血漿消耗,從而提高人工肝的質(zhì)控和安全性,為生物人工肝在肝衰竭治療中的廣泛開展和應(yīng)用開辟新的途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575.3
【圖文】：

圖2一3轉(zhuǎn)染hALR重組質(zhì)粒前后的肝細(xì)胞生長情的肝細(xì)胞系代謝功能檢測轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)應(yīng)用looml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液10ml，測利多卡因濃度，結(jié)果見表2一1。hALR肝細(xì)胞系的利多卡因代謝轉(zhuǎn)化結(jié)果利多卡因濃度(mg/L)利多卡因轉(zhuǎn)化oh80078632.521.25562842.5654hhhZh，‘漢一‘.且，山

BCA標(biāo)準(zhǔn)品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

llldZd3d4ddd培 培養(yǎng)時(shí)間間圖2一6轉(zhuǎn)染hALR重組質(zhì)粒前后肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中人白蛋白含量

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 John Brotherton;美國C3A細(xì)胞支持的生物人工肝研究進(jìn)展[J];實(shí)用肝臟病雜志;2005年05期

2 成軍;肝再生增強(qiáng)因子超家族研究進(jìn)展[J];生物學(xué)雜志;2000年01期

3 黃志剛,劉殿武;肝再生增強(qiáng)因子的研究進(jìn)展[J];中國病理生理雜志;2002年05期

本文編號(hào)：2776246