【摘要】：乙型和丙型肝炎病毒(Hepatitis B／C Virus，HBV／HCV)是引起肝硬化、原發(fā)性肝細胞癌等疾病的主要因素。在我國僅HBV慢性感染者就有1.25億，HCV感染者也高達3800萬。每年有大量的肝硬化病人死于包括原發(fā)性肝細胞癌在內(nèi)的多種并發(fā)癥。病毒感染者通常會經(jīng)歷病毒性肝炎——肝硬化——肝癌的典型病程，然而這一病程的確切機制并不清楚。病毒感染人體后與宿主細胞發(fā)生復雜的相互作用，其中涉及宿主細胞的多種基因、多種信號途徑。分析感染后病變肝臟細胞基因的表達變化，不僅可以從一定程度上理解病毒致病的分子生物學，而且也為揭示病毒性肝硬化、原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病機理提供依據(jù)。同時這些差異表達的基因則可能成為新的肝病診斷標志或治療靶點。 本研究選取正常肝臟組織和肝硬化組織(乙型肝炎病毒表面抗原陽性)、原發(fā)性肝細胞癌及癌旁組織(丙型肝炎病毒抗體陽性、核酸陽性)為研究對象，綜合多個研究者對代表性差異分析(representational difference analysis，RDA)技術的改進方案分別進行了兩組研究標本正向和反向的消減雜交，兩輪雜交后的產(chǎn)物被克隆到pGEM-T載體中。挑取部分陽性克隆制備雜交膜，分別以同位素標記來源于各研究標本的擴增子以及第二輪雜交產(chǎn)物為探針，進行高通量的斑點雜交，獲得多個差異表達的基因：(1)在肝硬化組織中上調(diào)的基因包括谷氨酸轉氨酶(glutaminase 1)、醛糖還原酶(aldo-keto reductase family 1 B10，AKR1B10)、鈣結合的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)蛋白(calcium-binding tyrosine 博士學位論文摘要 phosphorylation一regulated protein，CABYR)、雌激素應答B(yǎng)盒蛋白(Estrogen responsive B box protein，EBBP)等基因以及兩個對應于新基因的EST(expressed sequenee tag)片段等。下調(diào)表達的基因包括CD27結合蛋白(CD27 binding proteinSivas鸇27BP)和煙酞胺甲基轉移酶(nieotinamide N一methyltransferase，NNMT)等。(2)在肝癌組織中上調(diào)表達的基因有微管蛋白 (gamma一tubulin)，絲氨酸脫氫酶(serine dehydratase，SDS)，P450色素家 族蛋白(eytoehrome P450，fami ly 11，subfamilyB，PolypeptideZ，CYPXIBZ)。 下調(diào)表達的基因包括與外毒素酶解代謝以及血漿蛋白的合成的相關基因以及腫瘤 相關基因絲氨酸蛋白酶11(protease，serine 11，HTRA serine protease，pRSSll)、 原肌球蛋白一1(Tropomyosin一l，TM一l)以及兩個對應于新基因的EST片段等。選擇 部分基因進一步用半定量RT一PCR的方法鑒定其在相應類型標本中的表達。CABYR 基因在正常肝臟中不表達，而在所有的13份肝硬化組織中都激活表達，同時鈣結 合的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)蛋白基因在7/9的肝癌組織中上調(diào)表達，表明該基因于轉 錄水平上在肝病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前尚未有這一基因參與包括肝病在內(nèi)的 人類疾病的相關研究。PRSS 11、TM一1基因在9份肝癌組織中呈現(xiàn)了不同的表達模 式。 通過本研究，可以得出如下結論:(1)利用RDA技術分離獲得多個參與病毒 性肝硬化、肝癌發(fā)生的基因，其中包括一些新基因，EBBP、CABYR以及PRSSll基 因參與肝病的發(fā)生為我們首次報道。CABYR基因及其表達產(chǎn)物在肝癌發(fā)生中的作用 有待進一步研究。(2)結合RDA和高通量的再篩選可以有效分析細胞在病理狀態(tài)下 差異表達的基因，是了解宿主和病毒相互作用的有效方法。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R575.2;R735.7
【圖文】：

用于雜交的兩種擴增子范圍一致，適合于進一步的分析。在實驗中通過縮小雜交體系的規(guī)模，即將每輪所用驅動擴增子的量從40pg減少到5pg，大大減少了所需起始樣本的量。圖1一1顯示了來源于100“g總RNA在稀釋PcR法川以及1:100、1:800二輪雜交后，可以有效地富集大量的差異基因。參照文獻〔2，，為保留差異基因的多樣性，我們沒有進行更高比率的雜交。同時，正反向雜交產(chǎn)物顯示了不同產(chǎn)物模式，表明雜交的過程中沒有DNA污染。bP2000一n﨑一UO

本文編號：2776344