【摘要】：研究目的:阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)是最常見的兩種慢性呼吸系統(tǒng)性疾病,兩病共存稱為呼吸重疊綜合征(OS)。由于OSA和COPD兩種疾病均可引起體內(nèi)氧化及抗氧化失衡和白細(xì)胞的激活以及功能紊亂,所以容易誘發(fā)全身系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng),增高體內(nèi)炎癥因子水平,促進(jìn)重疊綜合征病情進(jìn)展和加重。從病理生理過程來看,OSA與COPD患者均會(huì)出現(xiàn)低氧血癥。OSA和COPD兩類患者的缺氧特征分別表現(xiàn)為夜間睡眠期間的間歇性缺氧與持續(xù)慢性缺氧。因缺氧導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng),致使與之有關(guān)的炎癥因子呈級聯(lián)放大瀑布式反應(yīng),從而引起相關(guān)并發(fā)癥,比如肺動(dòng)脈高壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病等。COPD和OSA都是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可見在OSA與COPD兩病共存的情況下,其有更高的心血管疾病合并癥風(fēng)險(xiǎn),死亡率更高,預(yù)后更差。目前對重疊綜合征及其合并癥的研究主要集中于臨床和流行病學(xué)方面,其它方面的研究還很少,尤其在細(xì)胞學(xué)方面的研究。本課題探索性地提出從細(xì)胞水平研究重疊(間歇伴持續(xù))模式低氧暴露下血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制,血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞交互作用機(jī)制及抗氧化劑Tempol和炎癥通道的阻斷劑PTDC進(jìn)行干預(yù)后對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用,以期為揭示重疊綜合征患者并發(fā)心血管疾病的可能發(fā)病機(jī)制與可行干預(yù)措施提供必要理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究內(nèi)容:1、從細(xì)胞水平研究間歇伴持續(xù)低氧暴露下中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制及各機(jī)制間相關(guān)性分析。2、細(xì)胞交互作用在重疊(間歇伴持續(xù))低氧暴露所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的重要性及細(xì)胞間黏附分子-1的作用研究。3、從細(xì)胞水平探究抗氧化劑Tempol和炎癥通道的阻斷劑PTDC對間歇伴持續(xù)低氧暴露所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。研究方法:第一部分:從健康志愿者抽取空腹外周靜脈血,應(yīng)用雙層密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞,然后將中性粒細(xì)胞與制備好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí),后應(yīng)用呼吸仿真系統(tǒng)(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科)進(jìn)行不同低氧模式(N、IH、CH、OS)的分組暴露,時(shí)間分為2小時(shí)、5小時(shí)、8小時(shí),各組分別留取中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)上清液、血管內(nèi)皮細(xì)胞。共進(jìn)行10次試驗(yàn)即n=10。通過ELISA法檢測上清液的炎癥因子IL-6,TNF-α及粘附分子ICAM-1�；瘜W(xué)試劑法檢測CAT活性、MDA濃度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞促凋亡基因Bak和抗凋亡基因Bcl-xl mRNA表達(dá)水平。第二部分:將中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞直接共培養(yǎng)的OS組與單純內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的OS(H)組同時(shí)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí),然后應(yīng)用天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科呼吸仿真系統(tǒng)進(jìn)行間歇伴持續(xù)低氧暴露8小時(shí),暴露后分別收集上清液和內(nèi)皮細(xì)胞。檢測指標(biāo)(同第一部分)。第三部分:將提取的中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后,一組進(jìn)行常氧暴露設(shè)為N組,其余三組均進(jìn)行間歇伴持續(xù)低氧暴露,不加入任何試劑的設(shè)為OS組,加入Tempol的設(shè)為(OS+T)組,加入PTDC的設(shè)為(OS+P)組,每組分別進(jìn)行2小時(shí)、5小時(shí)、8小時(shí)低氧暴露。暴露后分別收集上清液和內(nèi)皮細(xì)胞。檢測指標(biāo)(同第一部分)。研究結(jié)果:第一部分:1、上清液炎癥因子、粘附分子、氧化應(yīng)激各指標(biāo)比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同且具有時(shí)間依賴性:所檢測各指標(biāo)各組與N組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);TNF-a、IL-6、ICAM-1、MDA水平OS組高于IH組、CH組,CAT活力值OS組低于IH組、CH組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同:各指標(biāo)各組與N組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);OS組Bcl-x1、Bcl-x1/BAK表達(dá)水平低于IH組、CH組,BAK表達(dá)水平高于IH組、CH組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);隨著低氧暴露時(shí)間的延長,促凋亡基因及抑凋亡基因表達(dá)水平均表現(xiàn)出增加趨勢,而Bcl-x1/BAK水平呈下降趨勢,提示促凋亡基因起主要作用。3、炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)、凋亡基因的相關(guān)性分析:炎癥因子IL-6和TNF-α與抗氧化指標(biāo)CAT呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān),與氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA呈較強(qiáng)正相關(guān),P0.05;炎癥因子IL-6和TNF-α與凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān),P0.05;抗氧化指標(biāo)CAT與凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈較強(qiáng)正相關(guān),氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA與凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān),P0.05。第二部分:1、OS(H)組與OS組各指標(biāo)比較:OS(H)組IL-6、TNF-α、ICAM-1、MDA、BAKmRNA表達(dá)水平、Bcl-xl mRNA表達(dá)水平均低于OS組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),OS(H)組CAT的活力值、Bcl-xl/BAK比值均高于OS組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、ICAM-1與各變量相關(guān)性分析:ICAM-1與IL-6、TNF-α、MDA呈較強(qiáng)的正相關(guān);與CAT、Bcl-xl/BAK呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān),P0.05。第三部分:1、上清液炎癥因子、粘附分子及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同:TNF-a、IL-6、ICAM-1及MDA水平OS組高于N組、OS+T組、OS+P組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);OS+T組及OS+P組高于N組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);OS+T組與OS+P組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;且隨著暴露時(shí)間的逐漸延長,TNF-a、IL-6、ICAM-1及MDA濃度有升高趨勢。CAT活力值OS組低于N組、OS+T組、OS+P組,OS+T組及OS+P組低于N組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);OS+T組與OS+P組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但隨著低氧暴露時(shí)間的延長,CAT有下降趨勢。2、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同:OS組抑凋亡基因Bcl-x1表達(dá)水平及Bcl-x1/BAK比值低于N組、OS+T組、OS+P組,促凋亡基因BAK表達(dá)水平高于N組、OS+T組、OS+P組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);OS+T組及OS+P組抑凋亡基因Bcl-x1表達(dá)水平及Bcl-x1/BAK比值低于N組,OS+T組及OS+P組促凋亡基因BAK表達(dá)水平高于N組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);OS+T組與OS+P組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著低氧暴露時(shí)間的延長,促凋亡基因及抑凋亡基因表達(dá)水平均表現(xiàn)出增加趨勢;而Bcl-x1/BAK水平呈下降趨勢。研究結(jié)論:根據(jù)本課題研究可以得出如下結(jié)論:1、中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后間歇伴持續(xù)低氧暴露模式與常氧模式、間歇低氧模式、持續(xù)低氧模式相比炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激更劇烈、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速更明顯,內(nèi)皮損傷更嚴(yán)重。提示炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、及凋亡基因共同參與了重疊低氧暴露所致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。2、重疊低氧暴露模式所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有時(shí)間依賴性,隨著作用持續(xù)時(shí)間的增加,所致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷也在逐漸加重。3、氧化應(yīng)激、炎癥、及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因均參與了重疊低氧模式所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,三者之間兩兩存在強(qiáng)相關(guān)性�；ハ啻龠M(jìn),循環(huán)往復(fù),使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷呈級聯(lián)放大瀑布式加重。4、重疊低氧狀態(tài)下中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互作用使內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)的炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡更加劇烈。即中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的交互作用促使重疊低氧模式暴露下所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷更嚴(yán)重,5、黏附分子ICAM-1與炎癥因子、氧化/抗氧化指標(biāo)及凋亡基因均存在強(qiáng)相關(guān)性,在內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制中起了重要作用。6、重疊低氧暴露模式所致血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子及黏附分子增加,氧化應(yīng)激增強(qiáng)及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速均可被抗炎及抗氧化劑部分抑制�？寡准翱寡趸深A(yù)可以起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。具有治療重疊綜合征并發(fā)心血管疾病的潛力。7、抗炎及抗氧化治療早期應(yīng)用即產(chǎn)生效果,提倡早干預(yù),早治療�？梢员苊猱a(chǎn)生不良后果,導(dǎo)致多臟器功能受損。8、抗炎及抗氧化干預(yù)僅可部分保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,仍不能完全逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,考慮與內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制的多分子通道途徑有關(guān)。期待更進(jìn)一步的研究能夠通過多靶點(diǎn)精準(zhǔn)治療完全逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。9、低氧導(dǎo)致炎癥與氧化應(yīng)激具有強(qiáng)的相關(guān)性,試劑Tempol及PDTC都具有清除氧自由基ROS的抗氧化作用及抑制炎癥通道NF-κB的抗炎作用,兩種試劑的抗炎及抗氧化作用無明顯差異。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R766;R563.9
【圖文】：

圖 1：COPD 和 OSA 在易患心血管疾病的炎癥機(jī)制中的相互作用。 除腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）外，COPD 和 OSA 均與 C 反應(yīng)蛋白（CRP）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平升高有關(guān)， 并且還與氧化應(yīng)激有關(guān)。 然而，吸煙和肥胖是這些關(guān)聯(lián)中的混淆變量。 缺氧是 OSA 中 TNF-α產(chǎn)生升高的關(guān)鍵因素，這與重疊綜合征特別相關(guān)。 每種炎癥途徑都與動(dòng)脈粥樣硬化和隨后的心血管疾病有關(guān)。

課題總技術(shù)路線圖

圖 1.1 不同低氧暴露各組不同時(shí)段 TNF-a 濃度比較表 1.2 不同低氧暴露各組不同時(shí)段 IL-6 濃度比較（pg/ml n=10 x±S）組別 2h 5h 8hN 7.22±2.85c7.58±2.36c8.04±2.82dIH 34.70±8.83b46.59±19.32b107.30±28.79b*#CH 27.74±8.26b36.46±10.22b79.42±30.32c*#OS 53.09±20.05a67.46±13.17a*148.94±24.26a*#F 25.823 37.764 59.905P 0.000 0.000 0.000同列標(biāo)注不同字母(a>b>c>d)P＜0.05，與 2h 比較，*P＜0.05；與 5h 比較，#P＜0.05。

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10 何澤涌;;關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞研究的某些進(jìn)展[J];山西醫(yī)藥雜志;1987年05期

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本文編號：2785911