【摘要】：目的:中耳膽脂瘤是一種良性的鱗狀上皮角質(zhì)化增生性的病變,由鱗狀層狀角質(zhì)化上皮細(xì)胞組成,它表現(xiàn)為一種含有成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞的表皮樣囊腫。中耳膽脂瘤的特點(diǎn)是細(xì)胞過度增殖,伴隨的是角蛋白碎片的積累和顳骨及其周圍骨結(jié)構(gòu)的破壞。除導(dǎo)致聽力損傷和耳流膿外,膽脂瘤還可以導(dǎo)致多種顱內(nèi)外并發(fā)癥,如迷路炎、面癱、乙狀竇血栓性靜脈炎、腦膜炎、腦膿腫等。膽脂瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,影響因素很多,至今未明確其具體發(fā)病機(jī)制。RECK(反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白)基因是Takahashi等在1998年將v-ki-ras轉(zhuǎn)染細(xì)胞株NIH3T3中發(fā)現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)錄抑制基因。其表達(dá)在正常組織中普遍存在,但在許多腫瘤細(xì)胞系和由多種致癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞系中檢測(cè)不到,與許多腫瘤和炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的作用是通過抑制多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。MMP-2,9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中很重要的兩種,它以無(wú)活性的前體形式產(chǎn)生,作用非常廣泛。既可降解明膠與膠原、彈性蛋白(elastin)、層粘連蛋白(laminin)A鏈,又能降解間質(zhì)膠原和基質(zhì)蛋白等。MMP基因的嚴(yán)格調(diào)控對(duì)組織的破壞和重建平衡至關(guān)重要。如果過表達(dá),結(jié)締組織破壞會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)病理情況,像關(guān)節(jié)炎和牙周炎。目前在很多炎性疾病中RECK均為低表達(dá),但RECK在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中表達(dá)及生物學(xué)功能尚不清楚,本課題對(duì)RECK在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及在中耳膽脂瘤疾病進(jìn)展過程中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。研究方法:1、收集2017年2月~2017年10月在盛京醫(yī)院耳科病房手術(shù)的部分中耳膽脂瘤標(biāo)本36例,同時(shí)收集術(shù)耳外耳道皮膚29例(開放式乳突切除術(shù)+鼓室成形術(shù)+耳甲腔成型術(shù)中廢棄不用的外耳道皮膚的小碎塊)作為對(duì)照組。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)中耳膽脂瘤和外耳道皮膚中RECK、MMP2、MMP9的mRNA的表達(dá)情況。應(yīng)用Western Blot蛋白印跡檢測(cè)中耳膽脂瘤和外耳道皮膚中MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)情況。2、培養(yǎng)人永生化表皮細(xì)胞HaCaT(human immortalized keratinocyte),細(xì)胞的培養(yǎng)液為DMEM(含2ml-glutamine)+10%胎牛血清,培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2,恒溫孵箱貼壁培養(yǎng),三天傳代一次,傳代時(shí)用0.25%胰酶恒溫孵箱消化3min,重懸細(xì)胞按1:2傳代。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建沉默RECK基因和過表達(dá)RECK基因的HaCaT細(xì)胞。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RECK mRNA表達(dá)水平以評(píng)估是否成功構(gòu)建沉默RECK基因和過表達(dá)RECK基因的HaCaT;通過MTS法檢測(cè)沉默和過表達(dá)RECK對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果:1、RT-PCR結(jié)果顯示,中耳膽脂瘤中的RECK mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.723±0.099,低于外耳道皮膚1.181±0.121(P=0.004);中耳膽脂瘤中MMP2和MMP9的mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為11.180±3.158和99.350±31.920,顯著高于外耳道皮膚2.013±0.495(P=0.012)和1.522±0.529(P=0.007);Western Blot結(jié)果顯示,中耳膽脂瘤中的MMP2和MMP9的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為4.105±1.209和15.980±6.520,明顯高于外耳道正常皮膚0.666±0.215(P=0.040)和1.033±0.375(P=0.047)。2、si-RECK轉(zhuǎn)染組與con未轉(zhuǎn)染組RECK mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.581±0.107和1.033±0.033(P=0.016),si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細(xì)胞中RECK mRNA表達(dá)明顯低于con未轉(zhuǎn)染組,成功沉默RECK基因。OE-RECK轉(zhuǎn)染組與con未轉(zhuǎn)染組RECKmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為70.040±22.640和1.033±0.033(P=0.038),OE-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細(xì)胞中RECK mRNA表達(dá)明顯高于con未轉(zhuǎn)染組,成功過表達(dá)RECK基因。通過MTS法檢測(cè)下調(diào)RECK基因后HaCaT細(xì)胞的增殖能力的變化,第24h HaCaT細(xì)胞的con組、si-RECK NC組、si-RECK組細(xì)胞增殖情況分別為1.179±0.044,1.191±0.028,1.442±0.034,si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細(xì)胞增殖能力明顯高于si-RECK NC組(P=0.005)和空白對(duì)照組(P=0.009);第48h HaCaT細(xì)胞的con組、si-RECK NC組、si-RECK組細(xì)胞增殖情況分別為1.540±0.088,1.548±0.109,2.071±0.116,si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細(xì)胞增殖能力明顯高于si-RECK NC組(P=0.030)和空白對(duì)照組(P=0.022);第72h HaCaT細(xì)胞的con組、si-RECK NC組、si-RECK組細(xì)胞增殖情況分別為1.869±0.129,1.895±0.136,3.242±0.119,si-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細(xì)胞增殖能力明顯高于si-RECK NC組(P=0.001)和空白對(duì)照組(P=0.001),而si-RECK NC組與空白對(duì)照組HaCaT細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P0.05)。通過MTS法檢測(cè)RECK基因過表達(dá)后HaCaT細(xì)胞的增殖能力的變化,第24h HaCaT細(xì)胞的con組、OE-RECK NC組、OE-RECK組細(xì)胞增殖情況分別為1.553±0.042,1.579±0.040,1.196±0.035,OE-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細(xì)胞增殖能力明顯低于OE-RECK NC組(P=0.002)和空白對(duì)照組(P=0.002);第48h HaCaT細(xì)胞的con組、OE-RECK NC組、OE-RECK組細(xì)胞增殖情況分別為1.712±0.074,1.771±0.084,1.314±0.013,OE-RECK轉(zhuǎn)染組HaCaT細(xì)胞增殖能力明顯低于OE-RECK NC組(P=0.005)和空白對(duì)照組(P=0.006),而OE-RECK NC組與空白對(duì)照組HaCaT細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1、RECK在中耳膽脂瘤中的表達(dá)低于外耳道皮膚,MMP2和MMP9在中耳膽脂瘤中的表達(dá)高于外耳道皮膚。RECK,MMP2,MMP9的表達(dá)模式可能在中耳膽脂瘤疾病進(jìn)展過程中起到一定的促進(jìn)作用,還可能有助于為中耳膽脂瘤的臨床治療提供新的思路。2、干擾RECK基因可以調(diào)控HaCaT細(xì)胞的增殖能力,沉默RECK促進(jìn)細(xì)胞增殖,過表達(dá)RECK抑制細(xì)胞增殖,提示依據(jù)RECK基因而設(shè)計(jì)的分子診斷和基因治療有可能應(yīng)用于中耳膽脂瘤的臨床治療。
【圖文】：

圖 1 中耳膽脂瘤及外耳道皮膚中 RECK mRNA 的表達(dá)情況表外耳道皮膚組織，C 代表中耳膽脂瘤組織，*表示與外耳道皮膚對(duì)比 P<0.0P2 在中耳膽脂瘤中的表達(dá)高于外耳道皮膚。2 在中耳膽脂瘤中的表達(dá)明顯高與外耳道皮膚，用 2-ΔΔCT 計(jì)算組的 MMP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為 11.180±3.158 和 2.013±0學(xué)意義（P=0.012）。對(duì)樣本相對(duì)灰度值分析結(jié)果顯示，中耳膽脂白的相對(duì)表達(dá)量 4.105±1.209，高于外耳道皮膚 0.666±0.215（P=0

圖 2 MMP2 在中耳膽脂瘤與外耳道皮膚的表達(dá)情況A 圖上半部分為 MMP2 蛋白凝膠電泳圖，GAPDH 作為內(nèi)參，下半部分為 MMP2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。B 為 MMP2 在中耳膽脂瘤組織及外耳道皮膚中 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。N 代表外耳道皮膚，C 代表中耳膽脂瘤。*表示與外耳道皮膚對(duì)比 p<0.05。**表示與外耳道皮膚對(duì)比 P<0.01。3.3 MMP9 在中耳膽脂瘤的表達(dá)高于外耳道皮膚。中耳膽脂瘤和外耳道皮膚 MMP9 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為 99.350±31.920 和1.522±0.529，，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008），對(duì)樣本相對(duì)灰度值分析結(jié)果顯示，膽脂瘤中 MMP9 的相對(duì)表達(dá)量 15.980±6.520 顯著高于外耳道皮膚 1.033 ±0.375（P=0.047）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖 3 所示
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R764.2

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本文編號(hào)：2606102