發(fā)布時(shí)間：2017-07-17 15:22

  本文關(guān)鍵詞：機(jī)械拉伸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡影響的初步研究

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【摘要】：研究背景本研究源自對(duì)大量臨床現(xiàn)象的理性思考：機(jī)械應(yīng)激是組織修復(fù)的重要因素,減輕機(jī)械應(yīng)激可以減輕組織過度修復(fù)。皮膚修復(fù)過程中,關(guān)節(jié)活動(dòng)區(qū)域的瘢痕面積常常較非關(guān)節(jié)區(qū)域的大：骨折斷端由于固定不牢固常常會(huì)引起骨痂的大量增生,即組織過度修復(fù),而骨折斷端的絕對(duì)制動(dòng)后極少或不引起骨痂形成。由此,本研究推斷機(jī)械應(yīng)激是影響組織過度修復(fù)的重要因素之._。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：1、滴加α-氰基丙烯酸酯粘合劑可以減輕血管的過度運(yùn)動(dòng)；2、抑制血管的過度運(yùn)動(dòng)可以抑制血管內(nèi)膜過度增生。許多學(xué)者研究機(jī)械應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的影響,研究范圍廣泛。本研究是在細(xì)胞及分子生物水平上探討機(jī)械應(yīng)激對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響,通過對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞施加機(jī)械拉伸力,檢測(cè)在增殖及凋亡方面的變化,探索涉及的相關(guān)基因、蛋白及因子。目的為進(jìn)一步在細(xì)胞生物學(xué)水平上驗(yàn)證機(jī)械應(yīng)激可以導(dǎo)致組織過度修復(fù),本研究利用Flexcell-5000T細(xì)胞拉伸裝置,對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞施加機(jī)械拉伸力,通過調(diào)控拉伸力大小和拉伸時(shí)間,觀察力學(xué)前后細(xì)胞在分子生物水平上的變化,檢測(cè)涉及細(xì)胞增殖及凋亡的相關(guān)基因、蛋白及因子。方法(1)原代細(xì)胞提取及傳代培養(yǎng)：對(duì)體重在200-220g的雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈取材,組織貼塊法獲取原代平滑肌細(xì)胞,傳至3-8代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)細(xì)胞接受FX-5000T機(jī)械拉伸：將VSMCs以3x105個(gè)/ml的密度接種于Bioflex 6孔培養(yǎng)板上,拉伸強(qiáng)度范圍0～30%,拉伸時(shí)間0～120min。實(shí)驗(yàn)組：A組5%;B組10%；C組15%;D組20%；E組25%；F組30%拉伸強(qiáng)度；對(duì)照組：0%；觀察時(shí)間均為0,15,30,60,120min,頻率均為1Hz。(3)通過流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞周期,顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù),MTT法分析細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡,RT-PCR分析細(xì)胞增殖相關(guān)基因：α-SMA,ERK,MMP-2,NF-κB,PCNA水平,Western blot分析相關(guān)蛋白水平,ELISA檢測(cè)MCP-1、PDGF、TGF-β、VEGF細(xì)胞增殖相關(guān)因子的含量,分析細(xì)胞凋亡指標(biāo)過氧化氫含量。結(jié)果(1)B組10%拉伸強(qiáng)度持續(xù)15min時(shí)細(xì)胞周期S期比例最高,為54.65%；F組30%拉伸強(qiáng)度持續(xù)60mmin細(xì)胞周期S期比例最低,為8.17%。與對(duì)照組相比,P0.05。(2)B組10%拉伸強(qiáng)度持續(xù)15min細(xì)胞計(jì)數(shù)最多,為5675x106；F組30%拉伸強(qiáng)度細(xì)胞計(jì)數(shù)最少,為2636x106。與對(duì)照組相比,P0.05。(3)B組10%拉伸強(qiáng)度在波長(zhǎng)570nm測(cè)光吸收度值最高,為1.01；F組30%拉伸強(qiáng)度在波長(zhǎng)570nnm測(cè)光吸收度值最低,為0.60。與對(duì)照組相比,P0.05。(4)E組25%拉伸強(qiáng)度持續(xù)60min時(shí)細(xì)胞凋亡比例最高,為25.64%；B組10%拉伸強(qiáng)度在0mmin細(xì)胞凋亡比例最低,為4.34%。與對(duì)照組相比,P0.05。(5)10%強(qiáng)度持續(xù)15mina-SMA相關(guān)mRNA水平為1.94；ERK相關(guān)mRNA水平為2.23;MMP-2相關(guān)mRNA水平為2.11；NF-κB相關(guān)mRNA水平為1.33；PCNA相關(guān)mRNA水平為1.56。10%強(qiáng)度持續(xù)15mina-SMA相關(guān)蛋白水平為8.73;ERK相關(guān)蛋白水平為3.68；MMP-2相關(guān)蛋白A水平為4.79;NF-kB相關(guān)蛋白水平為8.52；PCNA相關(guān)蛋白水平為8.52。10%拉伸強(qiáng)度持續(xù)15minMCP-1的含量為482.47pg/ml;PDGF的含量為345.31pg/ml;TGF-β的含量為4563.19pg/ml; VEGF的含量為5 0.03pg/ml。10%拉伸強(qiáng)度持續(xù)15min時(shí)過氧化氫數(shù)值最低,為4.20 uM。結(jié)論(1)10%強(qiáng)度拉伸持續(xù)15分鐘顯著提高細(xì)胞周期S期的復(fù)制比,促進(jìn)細(xì)胞增殖,細(xì)胞計(jì)數(shù)增多；改變拉伸強(qiáng)度及時(shí)間影響細(xì)胞周期S期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2)25%強(qiáng)度拉伸持續(xù)60分鐘顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡；改變拉伸強(qiáng)度及時(shí)間影響細(xì)胞凋亡。(3)10%強(qiáng)度拉伸持續(xù)15分鐘,α-SMA, ERK, MMP-2, NF-kB, PCNA等細(xì)胞增殖相關(guān)基因和對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)水平較高；MCP-1、PDGF、TGF-β、VEGF因子等細(xì)胞增殖相關(guān)因子含量較高。
【關(guān)鍵詞】：機(jī)械拉伸 血管平滑肌細(xì)胞 細(xì)胞周期 細(xì)胞增殖 凋亡 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R654.3
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 引言13-16
• 實(shí)驗(yàn)部分16-54
• 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>16
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑16-17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器17
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法17-28
• 3.1 原代細(xì)胞提取及傳代培養(yǎng)17-18
• 3.2 細(xì)胞接受Flexcell-5000T機(jī)械拉伸18-19
• 3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期19-20
• 3.4 細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞計(jì)數(shù)20
• 3.5 MTT法分析細(xì)胞增殖20
• 3.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡20-21
• 3.7 RT-PCR分析細(xì)胞增殖相關(guān)基因21-23
• 3.8 Western blot分析細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白23-27
• 3.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)因子含量27
• 3.10 過氧化氫含量檢測(cè)27
• 3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27-28
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-50
• 5. 討論50-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 文獻(xiàn)綜述59-71
• 參考文獻(xiàn)65-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況71-72
• 致謝72

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