【摘要】：在過去的三十年中,糖尿病在全世界范圍內(nèi)已成為一種新型“流行病”,目前我國的糖尿病患者已超過1億,居全球第一位。對于糖尿病患者而言,任何創(chuàng)面均有可能發(fā)展形成嚴(yán)重感染的慢性創(chuàng)面,甚至造成截肢,嚴(yán)重影響愈合及患者生存質(zhì)量。在控制血糖的前提下,對于創(chuàng)面徹底清創(chuàng)、避免感染,促進(jìn)創(chuàng)面愈合是糖尿病創(chuàng)面主要的治療方式。但是傳統(tǒng)方法存在治療時(shí)間長、次數(shù)多、復(fù)發(fā)率高的問題,臨床對于新型有效的治療方法需求極大。羊膜位于胎盤最內(nèi)層,厚度約為8-12um,不含神經(jīng)及血管。研究表明羊膜具有促進(jìn)細(xì)胞遷移及擴(kuò)增、免疫源性低、減輕炎癥、含有大量的生長因子和細(xì)胞因子等特點(diǎn)。自1910年羊膜首次作為敷料用以創(chuàng)面治療以來,隨著保存技術(shù)的發(fā)展,使羊膜在眼科疾病、燒傷救治、整形修復(fù)、口腔疾病及神經(jīng)外科等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。羊膜上皮層是由單層立方上皮細(xì)胞構(gòu)成,稱之為羊膜上皮細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明,人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)多種干細(xì)胞標(biāo)志物,并具有向三個(gè)胚層分化的能力,而且能夠分泌多種生長因子。同時(shí)因其來源廣泛和便于分離,無免疫源性和致瘤性,使羊膜上皮細(xì)胞成為移植和再生醫(yī)學(xué)潛在的細(xì)胞來源。羊膜上皮細(xì)胞在組織修復(fù)中的應(yīng)用已有諸多報(bào)道,目前羊膜上皮細(xì)胞已在肝、神經(jīng)、肺、心肌甚至腫瘤治療中都有一定的優(yōu)勢,但是尚少有羊膜上皮細(xì)胞應(yīng)用于糖尿病創(chuàng)面的研究。因此在本課題中,我們通過提取培養(yǎng)羊膜上皮細(xì)胞,應(yīng)用于糖尿病創(chuàng)面中以觀察其對于創(chuàng)面愈合的作用并對其機(jī)制進(jìn)行初步探索。第一部分人羊膜上皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)鑒定及生物學(xué)特性檢測目的:分離培養(yǎng)人原代羊膜上皮細(xì)胞并檢測鑒定。方法:收集剖宮產(chǎn)胎盤分離羊膜,通過酶消化法提取羊膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測羊膜上皮細(xì)胞表型,免疫熒光法及RT-PCR法檢測羊膜上皮細(xì)胞干性標(biāo)志物,最后對其進(jìn)行三胚層誘導(dǎo)檢測其分化潛能。結(jié)果:體外人羊膜上皮細(xì)胞鏡下觀察可見細(xì)胞成鵝卵石樣成團(tuán)生長,核圓,居中,細(xì)胞呈多邊形,邊界清楚,輪廓分明。通過流式細(xì)胞儀檢測顯示培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,但是不表達(dá)CD45、CD34。通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)SSEA-3、SSEA-4、OCT4。RT-PCR結(jié)果顯示羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證明羊膜上皮細(xì)胞具有向三胚層分化潛能。結(jié)論:采用酶消化法成功分離培養(yǎng)羊膜上皮細(xì)胞,其可以表達(dá)多種干細(xì)胞標(biāo)志物,并能夠向三胚層分化,在組織修復(fù)中具有很大的潛力。第二部分羊膜上皮細(xì)胞促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合作用的研究目的:研究羊膜上皮細(xì)胞對于糖尿病創(chuàng)面愈合的作用。方法:將原代提取的羊膜上皮細(xì)胞局部注射糖尿病創(chuàng)面,觀察創(chuàng)面愈合情況。收集創(chuàng)面標(biāo)本行病理學(xué)以觀察創(chuàng)面愈合情況;行CD31免疫組化檢測創(chuàng)面血管化;行CD68、iNOS、CD206免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞極化;行促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和促進(jìn)愈合因子(VEGF、TGF-β1、IGF-1)的ELISA檢測炎癥反應(yīng)的改變。通過標(biāo)記羊膜上皮細(xì)胞,觀察羊膜上皮細(xì)胞在創(chuàng)面的轉(zhuǎn)歸情況。結(jié)果:(1)與空白組相比,羊膜上皮細(xì)胞組在創(chuàng)面第10、14天創(chuàng)面愈合率明顯升高(P0.01)。(2)通過病理檢測顯示創(chuàng)面第10天羊膜上皮細(xì)胞組新生肉芽組織厚度較PBS組明顯增加(P0.01);CD31免疫組化顯示創(chuàng)面羊膜上皮細(xì)胞組創(chuàng)面新生毛細(xì)血管密度較PBS組明顯增多(P0.01);羊膜上皮細(xì)胞組創(chuàng)面M1型巨噬細(xì)胞密度明顯低于PBS組(P0.01),M2型巨噬細(xì)胞密度明顯增對高(P0.05),M1/M2比例也明顯降低(P0.01);羊膜上皮細(xì)胞組創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表達(dá)量明顯高于PBS組的表達(dá)量(P0.01),而IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量明顯較空白組低(P0.01)。(3)羊膜上皮細(xì)胞植入創(chuàng)面第5天,可觀察到創(chuàng)面有大量羊膜上皮細(xì)胞存活;在創(chuàng)面第10天,可觀察到創(chuàng)面少量羊膜上皮細(xì)胞存活。結(jié)論:羊膜上皮細(xì)胞通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化、減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)面血管新生以促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合;同時(shí)其在創(chuàng)面存留時(shí)間較短,旁分泌作用可能在促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合過程中起主要作用。第三部分羊膜上皮細(xì)胞促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合機(jī)制的初步探討目的:探索羊膜上皮細(xì)胞對于糖尿病創(chuàng)面愈合作用的機(jī)制方法:(1)體外分離培養(yǎng)巨噬細(xì)胞,通過IFN-γ、TNF-α刺激模擬創(chuàng)面M0型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況,觀察羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基對于巨噬細(xì)胞極化的作用,同時(shí)收集細(xì)胞行RT-PCR檢測其基因表達(dá),實(shí)驗(yàn)分組為:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基+IFN-γTNF-α陽性對照組,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基+羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基+IFN-γTNF-α組,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基空白對照組。(2)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,通過CCK-8試劑盒、Transwell小室以及成管試驗(yàn)來觀察羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)對于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及成管能力的影響,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為3組:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基陽性對照組,羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基組,高糖DMEM陰性對照組。結(jié)果:(1)應(yīng)用羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基對于TNF-α和IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞可以減少細(xì)胞周圍的細(xì)短樹突狀突起;羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組巨噬細(xì)胞CD206(M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)的表達(dá)量較空白對照組(P0.01)和陽性對照組明顯升高(P0.01);而iNOS(M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)的表達(dá)量較空白組(P0.05)和陽性對照組明顯降低(P0.01)。(2)CCK-8試劑盒檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性顯示,應(yīng)用羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組較陰性對照組能夠明顯促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(P0.01);Transwell小室檢測遷移能力結(jié)果表明羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組細(xì)胞個(gè)數(shù)較陰性對照組明顯增多(P0.01);通過成管實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成管能力,結(jié)果顯示羊膜上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組成管個(gè)數(shù)較陰性對照組明顯增多(P0.01)。結(jié)論:羊膜上皮細(xì)胞可以明顯提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及成管能力,還可以逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化,同時(shí)可以促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并以此促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R641

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄭仕清;陳甜勝;紀(jì)世召;羅鵬飛;肖仕初;;羊膜移植物的制備及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中華燒傷雜志;2017年08期

2 朱琳楠;侯玉柱;趙勇;;精氨酸酶Ⅰ及誘生性一氧化氮合酶在巨噬細(xì)胞中的分子表達(dá)調(diào)控[J];中國免疫學(xué)雜志;2010年08期

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本文編號：2702301