【摘要】：研究背景:骨肉瘤(OS)是世界各地兒童和青少年有關(guān)癌癥死亡的主要原因之一。骨肉瘤的診斷和臨床治療取得了顯著的進(jìn)步,五年的總體生存率已提高到了70%以上。然而,對(duì)于那些患有晚期,惡性和/或復(fù)發(fā)性骨肉瘤的患者,預(yù)后仍然很差。因此,本研究組一直致力于了解骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制,并開(kāi)發(fā)新型抗骨肉瘤藥物。微小RNA(micro RNA)屬于一組小編碼調(diào)控RNA分子,其在OS中的作用越來(lái)越得到重視。研究目標(biāo):明確micro RNA-135b(miR-135b)抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖作用及其分子機(jī)制,為發(fā)現(xiàn)一種新穎、有效的靶向療法來(lái)治療這種異質(zhì)復(fù)雜的疾病提供分子生物學(xué)的依據(jù)。研究方法和內(nèi)容:1.運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR),蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)等方法研究人骨肉瘤組織及MG-63,U2OS人骨肉瘤細(xì)胞中miR-135b-5p、Ppm1e RNA的表達(dá)水平和Ppm1e、p-AMPKα1蛋白的的表達(dá)水平;2.轉(zhuǎn)染慢病毒包裹miR-135b-5p表達(dá)載體,在MG-63,U2OS人骨肉瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-135b-5p,運(yùn)用PCR,蛋白質(zhì)免疫印跡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Ppm1e RNA及蛋白和p-AMPKα1蛋白的表達(dá)水平變化;3.轉(zhuǎn)染慢病毒包裹miR-135b-5p表達(dá)載體,在MG-63,U2OS人骨肉瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-135b-5p,運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒,細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn),Brd U ELISA觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖變化;4.轉(zhuǎn)染慢病毒包裹Ppm1e shRNA敲減Ppm1e后,在MG-63人骨肉瘤細(xì)胞中,運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒,細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn),Brd U ELISA檢測(cè)觀察細(xì)胞增殖的變化;5.通過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒包裹的AMPKα1 shRNA或AMPKα1顯性負(fù)性遺傳突變(T172A)阻斷AMPK活化,在MG-63人骨肉瘤細(xì)胞中觀察它們對(duì)miR-135b-5p誘導(dǎo)的抗骨肉瘤細(xì)胞活性變化;6.將過(guò)表達(dá)Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的穩(wěn)轉(zhuǎn)U2OS人骨肉瘤細(xì)胞和對(duì)照的U2OS細(xì)胞建立裸鼠荷瘤模型,觀察上述腫瘤的生長(zhǎng)情況,并運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR,蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組化檢測(cè)miR-135b-5p Ppm1e RNA和Ppm1e p-AMPKα1蛋白的表達(dá)水平變化。研究結(jié)果:1.與周圍正常骨組織相比,miR-135b-5p和p-AMPKα1在人骨肉瘤組織中呈低表達(dá),而Ppm1e m RNA和蛋白高表達(dá);2.在MG-63,U2OS人骨肉瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染慢病毒包裹的miR-135b-5p,miR-135b-5p表達(dá)顯著上調(diào),并且顯著抑制Ppm1e表達(dá)并誘導(dǎo)AMPK磷酸化水平顯著上升;3.在MG-63,U2OS人骨肉瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-135b-5p顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖;4.在MG-63人骨肉瘤細(xì)胞中shRNA方法敲減Ppm1e后,p-AMPKα1水平增加,腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制;5.在MG-63人骨肉瘤細(xì)胞中,利用AMPKα1 shRNA或AMPKα1顯性負(fù)性遺傳突變(T172A)阻斷AMPK后幾乎逆轉(zhuǎn)了miR-135b-5p誘導(dǎo)的AMPK的活化的抗骨肉瘤細(xì)胞的活性的作用;6.將過(guò)表達(dá)Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的穩(wěn)轉(zhuǎn)U2OS人骨肉瘤細(xì)胞和對(duì)照的U2OS細(xì)胞建立裸鼠荷瘤模型相比,表達(dá)Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的腫瘤生長(zhǎng)顯著受到抑制,Ppm1e RNA和蛋白顯著下調(diào),p-AMPKα1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。研究結(jié)論:miR-135b-5p激活Ppm1e-AMPK信號(hào)通路抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖;
【圖文】：

人骨肉瘤組織中低表達(dá) AMPK 去磷酸化酶 Ppm1e 而達(dá)到激活新的研究表明，miR-135b-5p 是特 miR-135b-5p 的靶基因[13,14]。因此，表達(dá)水平。如圖 1 所示，與周圍正常骨 miR-135b-5p 表達(dá)水平顯著下調(diào)（“腫水平僅為周圍正常組織的 30％左右（織中低表達(dá)。圖 1

在人骨肉瘤組織中高表達(dá)。與周圍or”）組織內(nèi) Ppm1e mRNA 的表達(dá)10）。P<0.01 (和正常骨組織比較)。肉瘤組織中高表達(dá)肉瘤組織中 miR-135b-5p 低表達(dá)我們運(yùn)用 Western blotting（WB）示，和 mRNA 表達(dá)情況類似，，Ppm 10 組病人標(biāo)本的結(jié)果顯示，OS 組3）。圖 3
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：2703064