【摘要】：背景和目的嚴(yán)重的創(chuàng)傷或某些疾病可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷,發(fā)生一系列病理變化,并造成關(guān)節(jié)軟骨不可逆的退行性改變,最終引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),60歲以上人群中約有50%患病,75歲以上人群中的OA發(fā)病率高達(dá)80%。目前全世界OA患者有3.6億人,國內(nèi)最新統(tǒng)計(jì)資料調(diào)查顯示,我國骨關(guān)節(jié)炎患者已達(dá)1.2億。據(jù)美國統(tǒng)計(jì),每年應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎治療方面的花費(fèi)大約為5.46億美元,同時(shí)每年至少要進(jìn)行50萬例的關(guān)節(jié)成形手術(shù)。OA的發(fā)病通常還伴有關(guān)節(jié)疼痛,對患者的正常生活產(chǎn)生重大影響。在病情嚴(yán)重時(shí)甚至可能導(dǎo)致肢體殘疾,大大降低患者的生活質(zhì)量,該病的最終致殘率為53%,故有“頭號致殘疾病”之稱。由于關(guān)節(jié)軟骨的解剖結(jié)構(gòu)較為特殊,其周圍沒有血管和神經(jīng)的支配,因此一旦發(fā)生損傷就難以進(jìn)行自我的修復(fù)。因此深入研究對軟骨損傷的修復(fù)機(jī)制具有重要的臨床價(jià)值和社會意義。隨著近些年來組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展和不斷創(chuàng)新,組織工程軟骨逐漸成為一種理想的軟骨損傷的新型修復(fù)方式。其中,組織工程軟骨的細(xì)胞來源及誘導(dǎo)方法等問題一直是軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域研究的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)被認(rèn)為是目前利用組織工程進(jìn)行軟骨構(gòu)建過程中的一類非常理想的種子細(xì)胞,其具有來源廣泛、低免疫原性,具有高度的多向分化潛能以及在體外進(jìn)行多代增殖和培養(yǎng)后仍能夠保持原有細(xì)胞形態(tài)和生理功能等諸多優(yōu)勢。但是,有研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的MSCs在成軟骨分化的后期,并不會分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而形成關(guān)節(jié)軟骨,而是繼續(xù)分化為沒有修復(fù)作用的肥大化軟骨細(xì)胞,并最終形成無功能的纖維化軟骨或者鈣化。因此,如何抑制MSCs來源的軟骨細(xì)胞向肥大化軟骨細(xì)胞的分化,并使其保持軟骨細(xì)胞的相應(yīng)表型和特性,成為軟骨組織工程研究面臨的一個(gè)重要問題。軟骨的形成過程以及軟骨組織生物學(xué)功能的發(fā)揮,這些過程都是通過骨形成蛋白及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號通路等多種因子綜合調(diào)控的結(jié)果,同時(shí)這些調(diào)控因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近年來的研究表明,細(xì)胞內(nèi)的微小RNA(micro RNA,縮寫為mi RNA)在軟骨細(xì)胞分化以及生物學(xué)功能發(fā)揮的過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。在眾多的mi RNA中,miR-29b可以正向調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)的成骨分化。已有研究證實(shí),組蛋白去乙�；�4(histonedeacetylase4,hdac4)是mir-29b的下游靶基因之一。另外,hdac4可以通過降低軟骨細(xì)胞肥大化的標(biāo)志基因runx2的表達(dá),從而抑制軟骨細(xì)胞肥大化。由此,我們推測mir-29b很可能通過調(diào)節(jié)其下游的hdac4來影響bmscs成軟骨細(xì)胞分化的過程,使之向肥大化的軟骨細(xì)胞分化。本研究應(yīng)用mir-29b過表達(dá)和mir-29b抑制技術(shù),針對這一可能調(diào)控過程及機(jī)制進(jìn)行了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。材料與方法在課題組已建立的mscs軟骨肥大化誘導(dǎo)體系的基礎(chǔ)上,本研究對mir-29b在mscs成軟骨分化過程中的作用及其機(jī)制進(jìn)行探討。一、采用已建立mscs軟骨肥大化誘導(dǎo)體系培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)。番紅o固綠染色法檢測細(xì)胞團(tuán)的硫酸軟骨素的表達(dá)情況,確定體外成軟骨肥大化誘導(dǎo)成功與否。并分別取3、7、14、21、28d的細(xì)胞團(tuán),采用rt-pcr檢測colii、colx、runx2、sox9、hdac4和mir-29b的mrna的表達(dá)情況。二、在前一部分研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行mir-29b干預(yù)mscs成軟骨肥大化的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組包括:①過表達(dá)組,轉(zhuǎn)染pre-mir-29b;②過表達(dá)對照組,轉(zhuǎn)染negativecontrol;③抑制組,轉(zhuǎn)染antagomir-29b;④抑制對照組,轉(zhuǎn)染antagomir-29bcontrol。所有實(shí)驗(yàn)組均于細(xì)胞誘導(dǎo)的第10d進(jìn)行首次轉(zhuǎn)染,然后每間隔2d進(jìn)行補(bǔ)充轉(zhuǎn)染。分別取誘導(dǎo)培養(yǎng)至第14d、21d和28d的軟骨細(xì)胞,用rt-pcr的方法檢測mir-29b在過表達(dá)和抑制表達(dá)的情況下對軟骨肥大化的相關(guān)基因colii、colx、sox9、mmp13、runx2等的mrna表達(dá)的影響。運(yùn)用番紅o固綠染色法檢測抑制組軟骨細(xì)胞中硫酸軟骨素分泌情況。利用免疫組化和westernblot方法,從蛋白水平證實(shí)mir-29b在軟骨肥大化的調(diào)控作用。結(jié)果一、番紅o固綠染色法發(fā)現(xiàn),與對照組相比,肥大化組的軟骨細(xì)胞硫酸軟骨素分泌減少,尤其在誘導(dǎo)28d時(shí)差異顯著(p0.05),顯示體外誘導(dǎo)肥大化成功。軟骨標(biāo)志性基因coliimrna的表達(dá):成軟骨階段呈上升趨勢,肥大化階段呈下降趨勢(p0.05);肥大化相關(guān)基因colxmrna表達(dá):成軟骨階段表達(dá)量較低,肥大化階段顯著升高(p0.05)。runx2和mir-29b的表達(dá)量在成軟骨階段水平較低,在軟骨細(xì)胞肥大化的階段則顯著上升(p0.05);相反,sox9的表達(dá)在成軟骨階段上升,而處于肥大化階段的細(xì)胞中表達(dá)下降(p0.05)。據(jù)此,我們認(rèn)為下調(diào)mir-29b的表達(dá)水平可延緩或阻斷mscs來源的軟骨細(xì)胞的肥大化進(jìn)程。二、利用mi R-29b干預(yù)MSCs向成軟骨細(xì)胞肥大化的方向分化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在mi R-29b過表達(dá)組,軟骨分化的相關(guān)基因Col II、HDAC4和Sox9的m RNA表達(dá)較對照組顯著降低(P0.05),而軟骨肥大化的相關(guān)基因Col X、MMP13和Runx2的mRNA表達(dá)顯著升高(P0.05);在抑制mi R-29b表達(dá)組中則相反,軟骨細(xì)胞肥大的相關(guān)基因表達(dá)較對照組顯著降低(P0.05),而軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)則會顯著升高(P0.05)。在番紅O固綠染色實(shí)驗(yàn)中,抑制mi R-29b的細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的分泌量較對照組顯著增多。在免疫組化實(shí)驗(yàn)中,抑制mi R-29b的實(shí)驗(yàn)組X膠原的表達(dá)量較高。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示:mi R-29b過表達(dá)組的Col II、HDAC4和Sox9蛋白水平顯著升高(P0.05),Col X、Runx2的mRNA表達(dá)顯著下降(P0.05);而抑制miR-29b表達(dá)組中各蛋白的表達(dá)情況則與過表達(dá)組相反。結(jié)論mi R-29b為軟骨細(xì)胞肥大化的正性調(diào)控因子,mi R-29b能促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程,抑制miR-29b可延緩軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R684
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4 張e，
本文編號：2405363
