【摘要】：角膜是位于眼球最前壁的一層透明膜,具有一定的曲率半徑,在維持視功能和保護(hù)眼球方面發(fā)揮了不可替代的重要功能。人角膜由上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層構(gòu)成,其中,厚度約50μm的上皮層由6-8層人角膜上皮細(xì)胞(HCEP細(xì)胞)構(gòu)成,厚度約500μm的基質(zhì)層由人角膜基質(zhì)細(xì)胞(HCS細(xì)胞)和主要由膠原蛋白組成的高度有序的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成,厚度約5μm的內(nèi)皮層由單層人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(HCE細(xì)胞)組成。角膜因位于眼表最前端,直接與外界接觸,故極易受到損傷和感染,一旦發(fā)生病變將會引起角膜混濁、視力下降甚至致盲。目前,臨床上治療角膜病盲的唯一有效手段是角膜移植。但遺憾的是,由于捐獻(xiàn)角膜數(shù)量的嚴(yán)重不足及捐獻(xiàn)角膜老化,致使絕大數(shù)角膜病盲患者無法通過角膜移植重見光明。近年來角膜組織工程技術(shù)的快速發(fā)展,使組織工程角膜的體外構(gòu)建成為可能,而組織工程角膜作為捐獻(xiàn)角膜的等效替代物,則是目前從根本上解決捐獻(xiàn)角膜高度匱乏問題、使眾多角膜病盲患者恢復(fù)視功能的唯一希望。如何獲得足量正常的種子細(xì)胞和生物相容性理想的載體支架一直是制約組織工程角膜規(guī)�；w外構(gòu)建的兩大因素,已成為角膜組織工程領(lǐng)域的研究熱點和難點。在種子細(xì)胞方面,目前的研究主要集中在干細(xì)胞、轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞系和原代組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)上,但由于體外培養(yǎng)條件、倫理或潛在致瘤性等多種限制,目前仍無法滿足組織工程角膜規(guī)�；瘶�(gòu)建對種子細(xì)胞的需求。近年來,本實驗室成功建立了非轉(zhuǎn)染無致瘤性的HCE、HCS和HCEP的三種組織細(xì)胞系,并以其為種子細(xì)胞先后進(jìn)行了組織工程人角膜內(nèi)皮、基質(zhì)和上皮的體外構(gòu)建研究,達(dá)到了較為理想的動物移植效果,使利用非轉(zhuǎn)染人角膜組織細(xì)胞系規(guī)模化構(gòu)建組織工程角膜成為可能。在載體支架方面,目前的研究主要集中在天然生物材料、人工合成高分子材料和生物大分子復(fù)合材料方面。鑒于天然生物材料或多或少地受到其病原體攜帶風(fēng)險和來源的限制、人工合成高分子材料還存在有生物相容性不理想等缺陷,學(xué)者們便逐漸將研究重點轉(zhuǎn)移到生物大分子復(fù)合材料的研發(fā)方面。在生物大分子復(fù)合材料的研究中,膠原蛋白由于具有來源廣泛、在進(jìn)化上高度保守、免疫原性低且生物相容性理想等諸多優(yōu)勢,已被廣泛用于各種載體支架材料的制備研究,且利用人膠原蛋白復(fù)合支架成功構(gòu)建出了組織工程角膜,但遺憾的是,所制備出的膠原蛋白復(fù)合支架仍然存在有力學(xué)性能欠佳、體內(nèi)降解速度過快和制備成本較高等缺陷。近年來,高效無毒交聯(lián)劑及其交聯(lián)技術(shù)的快速發(fā)展以及非酶解/完整分子魚類膠原蛋白制備技術(shù)的建立,為利用魚類膠原蛋白制備組織工程角膜載體支架創(chuàng)造了條件。本文在前期研究工作的基礎(chǔ)上,首次利用本實驗室自主分離純化的非酶解/完整分子魚類膠原蛋白啟動了魚類膠原蛋白支架的制備研究,進(jìn)而以其為載體支架、以非轉(zhuǎn)染無致瘤性的三種組織細(xì)胞系作為種子細(xì)胞進(jìn)行了組織工程全層人角膜(TE-flHC)的體外構(gòu)建研究,旨在建立魚類膠原蛋白支架的制備與TE-flHC體外構(gòu)建的技術(shù)工藝,獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)、屬性和功能蛋白表達(dá)正常的TE-flHC。為了利用魚類膠原蛋白制備出生物相容性理想的載體支架,本文采用本實驗室業(yè)已純化的孔鰩魚皮膠原蛋白,選用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)交聯(lián)劑和自制模具,進(jìn)行了魚類膠原蛋白支架的制備和鑒定。魚類膠原蛋白的鑒定結(jié)果顯示,所純化的孔鰩魚皮膠原蛋白純度高,在SDS-PAGE電泳中無雜帶,存在形式分別為單股α鏈、雙股α鏈和三股α鏈,單α鏈的分子量約為120 kDa, Gly含量約占總氨基酸含量的32.34%,符合膠原蛋白的分子量和氨基酸組成的基本特征,為未被降解的膠原蛋白完整分子,可用于魚類膠原蛋白復(fù)合支架的制備。在對所純化膠原蛋白進(jìn)行鑒定之后,本文以所得魚膠原蛋白為原料,采用自制裝置并通過EDC/NHS交聯(lián)改性制備出了魚類膠原蛋白支架。含水量測定結(jié)果顯示,60mg/mL、80 mg/mL和100mg/mL膠原蛋白支架的含水量分別為90.53%±0.06%、89.88%±0.03%和86.34.%±0.11%；透明度與透光率結(jié)果顯示,上述三種膠原蛋白支架均具有良好的透明度,其透光率分別為91.15±2.36%、89.77±2.30%和86.09±2.31%；力學(xué)性能檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),增加膠原蛋白支架的抗拉強度和斷裂伸長率隨膠原蛋白的濃度升高而提高。冰凍切片HE染色和掃描電鏡結(jié)果表明,100 mg/mL膠原蛋白支架相對于60 mg/mL和80 mg/mL膠原蛋白支架,其組織結(jié)構(gòu)較為致密,膠原纖維連續(xù),孔徑大小均勻,內(nèi)部結(jié)構(gòu)最佳。以上結(jié)果說明,所制備的魚類膠原蛋白支架具有良好的光學(xué)性能、力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu),可望用作TE-flHC體外構(gòu)建的載體支架。為了獲得足量的人角膜種子細(xì)胞,本文首先對業(yè)已建立的三種非轉(zhuǎn)染人角膜組織細(xì)胞系進(jìn)行了擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定。形態(tài)觀察和生長曲線的鑒定結(jié)果顯示,HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞仍分別保持有上皮樣、成纖維樣和多角形內(nèi)皮樣的形態(tài)特征,其群體倍增時間分別為38.5h、37.6 h和36.2 h；染色體鑒定結(jié)果顯示,這三種細(xì)胞的特征染色體數(shù)目均為2n=46條；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCEP細(xì)胞仍保持有其標(biāo)志蛋白——角蛋白3/12以及功能蛋白——緊密連接蛋白(ZO-1),整聯(lián)蛋白131、間隙連接蛋白-43、鈉鉀泵和乙醛脫氫酶的陽性表達(dá)；HCS細(xì)胞仍保持有其標(biāo)志蛋白——波形蛋白以及功能蛋白——整聯(lián)蛋白p1、間隙連接蛋白-43、鈉鉀泵和乙醛脫氫酶(ALDH)的陽性表達(dá)；HCS細(xì)胞仍保持有標(biāo)志蛋白——血管內(nèi)皮生長因子受體蛋白(FLK-1)以及功能蛋白——整聯(lián)蛋白β5,緊密連接蛋白(ZO-1),間隙連接蛋白-43和鈉鉀泵的陽性表達(dá)。這些結(jié)果表明,體外擴(kuò)增培養(yǎng)的三種人角膜組織細(xì)胞在形態(tài)、增殖能力、染色體特征以及功能蛋白表達(dá)方面仍然具有典型的原有屬性和發(fā)揮形成細(xì)胞連接和穿膜運輸?shù)臐撃?可作為種子細(xì)胞用于TE-flHC的體外構(gòu)建。為了驗證所制備的魚類膠原蛋白支架的生物相容性,本文在獲得足量的人角膜種子細(xì)胞后,利用MTT法、RT-PCR和免疫組織化學(xué)等方法檢測了支架對三種人角膜組織細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞的生長與增殖調(diào)控基因表達(dá)以及功能蛋白表達(dá)的影響作用。MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),魚類膠原蛋白支架浸提液對體外培養(yǎng)的HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞的細(xì)胞活力沒有顯著影響(P0.05)。RT-PCR結(jié)果表明,支架對三種種子細(xì)胞生長和增殖基因的表達(dá)水平也沒有顯著影響(P0.05)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,HCEP細(xì)胞在接種于支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——角蛋白3/12、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白p1、ZO-1和間隙連接蛋白-43以及功能蛋白——鈉鉀泵和ALDH的陽性表達(dá)；HCS細(xì)胞在接種于支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——波形蛋白、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白β1和間隙連接蛋白-43、以及功能蛋白——鈉鉀泵和ALDH的陽性表達(dá)；HCE細(xì)胞在接種于支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——FLK-1、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白β5、ZO-1和間隙連接蛋白-43、以及功能蛋白——鈉鉀泵的陽性表達(dá)。這些結(jié)果表明,所制備的魚類膠原蛋白支架對三種人角膜組織細(xì)胞不僅沒有毒性,而且對其生長增殖調(diào)控基因、標(biāo)志蛋白及功能蛋白的表達(dá)沒有任何影響作用,與三種人角膜組織細(xì)胞具有理想的生物相容性,可以作為載體支架用于TE-flHC的體外構(gòu)建。在獲得足量正常的三種人角膜組織細(xì)胞和生物相容性理想的魚類膠原蛋白支架后,本文以三種人角膜組織細(xì)胞為種子細(xì)胞、以魚類膠原蛋白支架為載體支架,進(jìn)行了TE-flHC的體外構(gòu)建和鑒定研究。我們在優(yōu)化種子細(xì)胞的接種天數(shù)后,分別將HCS細(xì)胞、HCE細(xì)胞和HCEP細(xì)胞接種于魚類膠原蛋白支架,通過浸沒培養(yǎng)或液氣-液界面培養(yǎng)數(shù)天后成功構(gòu)建TE-flHC,并通過外觀觀察、透明度檢測、冰凍切片HE染色、熒光標(biāo)記物檢測、茜素紅染色、透射電鏡、掃描電鏡和免疫組織化學(xué)檢測對其透光性能、組織結(jié)構(gòu)及種子細(xì)胞的蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行鑒定。透光性能檢測結(jié)果表明,構(gòu)建的TE-flHC具有良好的透光率與透明度,具有類似正常角膜的高透光性能。熒光標(biāo)記物檢測與HE染色結(jié)果表明,三種人角膜細(xì)胞分界明顯,HCEP細(xì)胞在支架表面形成5至8層復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)；HCS細(xì)胞均勻分布于支架內(nèi)部；HCE細(xì)胞形成完整的細(xì)胞單層結(jié)構(gòu)。茜素紅染色結(jié)果表明,細(xì)胞密度為2750±260個/mm2,相當(dāng)于30歲成年人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明,HCEP細(xì)胞具有豐富的微絨毛結(jié)構(gòu),角膜上皮細(xì)胞與魚類膠原蛋白支架的連接處存在致密的基底膜,并且細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-支架之間結(jié)合緊密；HCS細(xì)胞呈纖維樣,形態(tài)伸展,與魚類膠原蛋白支架連接緊密；HCE細(xì)胞平整連續(xù),形成了由完整的單層結(jié)構(gòu),與正常角膜內(nèi)皮層相似。以上結(jié)果說明構(gòu)建的TE-flHC具有類似于正常角膜的解剖結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,三種人角膜組織細(xì)胞均能維持其原有屬性,并且形成了緊密連接、錨定連接和通訊連接,具有正常角膜相似的進(jìn)行膜泡運輸和抗UV氧化損傷的功能。綜上所述,本文利用孔鰩皮膠原蛋白制備出了光學(xué)性能、力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)良好且與HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞具有理想生物相容性的魚類膠原蛋白支架,進(jìn)而以膠原蛋白支架為載體支架,以屬性正常、增殖能力旺盛及功能蛋白表達(dá)正常的非轉(zhuǎn)染HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞為種子細(xì)胞,成功體外構(gòu)建出了與正常角膜結(jié)構(gòu)、屬性與功能相似的組織工程全層角膜。本文研究結(jié)果,對于魚類膠原蛋白在組織工程領(lǐng)域的高質(zhì)化應(yīng)用具有重要意義,為我國數(shù)百萬、全世界有數(shù)千萬角膜病盲患者早日通過TE-flHC移植重見光明帶來希望。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08

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本文編號：2340280