本文關(guān)鍵詞：Paget骨病家系相關(guān)基因篩查及候選基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Paget骨病是一種慢性進行性的代謝性骨病，以過度紊亂的骨更新為特征，可引起骨痛、骨畸形、導(dǎo)致病理性骨折及其他并發(fā)癥，病變可累及全身一處或多處骨骼,以中軸骨和承重的四肢骨多見。病灶處發(fā)現(xiàn)巨大多核的破骨細胞增多，且活性增強。Paget骨病分為散發(fā)性和家族性，在西歐、北美等地區(qū)多見。該病的發(fā)病機制還未完全清楚，普遍認為環(huán)境因素與遺傳因素共同影響該疾病的發(fā)生。在新西蘭、澳大利亞和南非等國家中，來自高患病率地區(qū)的移民Paget骨病患病率明顯高于本地人。Paget骨病患病率在種族上的差異性及家族性聚集性提示遺傳因素在其發(fā)病機制中有重要作用。Paget骨病患者往往有陽性家族史，通常呈常染色體顯性遺傳，不完全外顯率較高。近年來，隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對Paget骨病遺傳病因的研究不斷深入。新近研究發(fā)現(xiàn)，，RANK/RANKL和NF-kB信號通路分子如SQSTM1/p62等基因突變與破骨細胞的異�；罨癙aget骨病的發(fā)生有關(guān)，但半數(shù)以上的該病患者未發(fā)現(xiàn)這些突變，提示其他基因變異可能參與其發(fā)生發(fā)展。 目的 在對Paget骨病家系進行已知易感基因檢測的基礎(chǔ)上，利用全基因外顯子測序技術(shù)篩查相關(guān)基因突變，并對篩查的疾病候選基因ASB16及FKBP5基因進行功能研究，探討其在Paget骨病發(fā)病的作用，為深入了解其發(fā)病的遺傳學(xué)機制奠定基礎(chǔ)。 方法 1. SQSTM1及TNFRSF11A基因突變篩查：抽取家系成員外周血并提取全血基因組DNA，通過查閱文獻確定SQSTM1及TNFRSF11A為該Paget骨病家系的基因篩查的候選基因，針對兩個基因的全部外顯子分別設(shè)計引物，PCR擴增，對擴增產(chǎn)物直接DNA測序，結(jié)果用軟件Sequencher5.0Demo分析。 2. ASB16基因啟動子活性的研究：通過對患者全基因外顯子測序，發(fā)現(xiàn)ASB16基因5’端+27處G/C雜合性變異。通過對正常樣本測序篩查，統(tǒng)計ASB16基因待測位點在正常人群中基因型分布頻率。應(yīng)用啟動子預(yù)測軟件確定包括該變異位點的候選啟動子區(qū)域，經(jīng)PCR擴增活得該啟動子基因片段，將基因片段插入pMD-18T克隆載體，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-18T/ASB16，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，通過DNA測序篩選突變型和野生型陽性克隆質(zhì)粒。構(gòu)建熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16，NheⅠ，Hind Ⅲ雙酶切pMD-18T/ASB16克隆載體，將切下回收ASB16基因啟動子片段插入質(zhì)粒pGL3-basic中。在脂質(zhì)體的作用下，將重組的熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3/ASB16與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染真核細胞HEK293，培養(yǎng)48小時后，通過檢測熒光素酶活性反應(yīng)啟動子活性，結(jié)果用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0分析。 3.人FKBP5基因的克隆表達及純化：通過對患者全基因外顯子測序，在FKBP5基因中發(fā)現(xiàn)G/C雜合性變異。為研究該突變對FKBP5功能的影響極其在Paget骨病發(fā)病中的作用，進行野生型和突變型FKBP5表達的研究。針對目的基因片段設(shè)計引物，并加入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位點，C端加入6×His的His-Tag標簽。通過PCR擴增獲得野生型和突變型的目的基因片段，插入pMD-18T克隆載體，構(gòu)建野生型及突變型的重組克隆質(zhì)粒pMD-18T/FKBP5，菌落PCR篩選陽性克隆，并DNA測序分析鑒定。分別構(gòu)建野生型及突變型的pET-11d/FKBP5原核表達載體，重組克隆質(zhì)粒pMD-18T/FKBP5經(jīng)NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，將瓊脂糖凝膠電泳分離純化的FKBP5基因片段插入雙酶切后的原核表達載體pET-11d中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR及酶切分析鑒定重組表達質(zhì)粒。分別將野生型和突變型的重組質(zhì)粒pET-11d/FKBP5轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株，挑取單克隆菌落培養(yǎng)至對數(shù)期，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析和Western blot鑒定重組蛋白。重組人FKBP5蛋白的純化，誘導(dǎo)表達的重組人FKBP5分別收集菌裂解上清和包涵體沉淀，做SDS-PAGE分析蛋白表達形式，在非變性條件下，采用Ni2+-NTA親和層析法對目的蛋白進行純化，做SDS-PAGE分析目的蛋白的純度。 結(jié)果 1. SQSTM1及TNFRSF11A基因突變篩查 在該家系中未發(fā)現(xiàn)與Paget骨病共分離的致病基因突變，檢測到14個已知的單核苷酸多態(tài)性。提示SQSTM1及TNFRSF11A不是該家系的致病基因。 2. ASB16基因啟動子活性的研究 2.1正常人群ASB16突變率的研究：正常樣本篩查結(jié)果ASB16基因待測位點基因型GC頻率2.74%，基因型GG頻率97.26%，提示該變異為新發(fā)現(xiàn)的SNP。 2.2熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建：PCR擴增的ASB16基因候選啟動子片段，電泳可見463bp處有明亮條帶，與設(shè)計一致。將ASB16基因候選啟動子片段與線性克隆載體pMD-18T連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選及DNA測序鑒定，成功獲得了野生型及突變型的克隆載體pMD-18T/ASB16。分別將野生型和突變型ASB16基因候選啟動子基因片段插入熒光素酶報告基因載體pGL3-basic中，通過PCR和DNA測序鑒定正確，成功構(gòu)建了野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16。 2.3啟動子活性檢測：熒光素酶活性檢測，與陰性對照組相比，重組的熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16熒光素酶活性升高（P0.05）；野生型與突變型pGL3/ASB16相比，熒光素酶活性無顯著差異（P0.05）。提示該突變不影響ASB16啟動子的活性，不是該家系致病基因。 3.人FKBP5基因的克隆表達及純化 3.1表達載體的構(gòu)建：PCR擴增的野生型及突變型FKBP5基因片段，電泳可見1400bp處有明亮條帶，與設(shè)計一致。分別將FKBP5基因片段與線性克隆載體pMD-18T連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選及DNA測序鑒定，成功獲得了野生型及突變型的克隆載體pMD-18T/FKBP5。通過NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切克隆載體pMD-18T/FKBP5，將FKBP5基因片段插入原核表達載體pET-11d中，并通過雙酶切和菌落PCR鑒定正確，成功構(gòu)建了野生型和突變型原核表達載體pET-11d/FKBP5。 3.2人FKBP5蛋白的表達鑒定及純化：野生型和突變型菌株經(jīng)擴增、IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)后的重組菌株在52kD處出現(xiàn)明顯目的條帶，并且目的蛋白大部分以可溶性形式表達于菌體的超聲上清中。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白與抗人FKBP5多克隆抗體和抗His-Tag單克隆抗體均能發(fā)生特異性結(jié)合，表明獲得的重組蛋白為特異性FKBP5蛋白。非變性條件下，采用Ni2+-NTA親和層析法對目的蛋白進行純化，進行SDS-PAGE分析，F(xiàn)KBP5蛋白純度達到85%以上。 結(jié)論 1. SQSTM1及TNFRSF11A不是該家系的致病基因：SQSTM1及TNFRSF11A的基因突變篩查中，在該家系中未發(fā)現(xiàn)與Paget骨病共分離的致病基因突變，檢測到14個已知的單核苷酸多態(tài)性，排除這兩個基因為該家系Paget骨病致病基因的可能性。 2. ASB16基因上游新發(fā)現(xiàn)的SNP與該家系的發(fā)病無關(guān)：成功構(gòu)建了野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體pGL3/ASB16，ASB16基因候選啟動子有一定的啟動活性，野生型與突變型啟動活性無明顯差異，該位點的變異對ASB16基因的啟動活性無顯著影響，提示新發(fā)現(xiàn)的SNP和Paget病的發(fā)病無關(guān)。 3.人FKBP5蛋白的表達純化：成功構(gòu)建了野生型和突變型的人FKBP5基因的原核表達載體，純化得到了純度較高的人FKBP5蛋白，為今后進一步對該蛋白的生物學(xué)活性及功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Paget骨病 SQSTM1基因 TNFRSF11A基因 單核苷酸多態(tài)性 ASB16啟動子 報告載體pGL3 FKBP5 原核表達
【學(xué)位授予單位】：濟南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R681;R3416
【目錄】：

• 目錄6-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-16
• 主要符號表16-18
• 前言18-20
• 第一部分 Paget 骨病家系 SQSTM1 及 TNFRSF11A 基因突變篩查20-34
• 材料20-22
• 方法22-26
• 結(jié)果26-33
• 小結(jié)33-34
• 第二部分 ASB16 基因變異驗證及其啟動子活性研究34-55
• 材料34-38
• 方法38-47
• 結(jié)果47-54
• 小結(jié)54-55
• 第三部分 野生和突變 FKBP5 基因的克隆表達及純化55-76
• 材料55-59
• 方法59-68
• 結(jié)果68-75
• 小結(jié)75-76
• 討論76-80
• 結(jié)論80-81
• 參考文獻81-83
• 文獻綜述83-89
• 參考文獻86-89
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果89-90
• 致謝90

【共引文獻】

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本文編號：406562