本文關鍵詞：三種生物恐怖因子重組優(yōu)勢抗原表位融合蛋白的表達、純化及活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：生物恐怖活動由于對人群的普遍易感性、不可預見性以及強大的殺傷力，已日益引起世界各國的廣泛關注。目前，全世界至少有15個國家和地區(qū)可能有生物戰(zhàn)計劃，主要集中在我國周邊地區(qū)。因此，研制針對生物恐怖戰(zhàn)劑的快速、靈敏、準確的檢測試劑與方法十分必要。膠體金免疫層析法（GICA）具有快速、簡便，且不需專門專業(yè)技術人員操作等優(yōu)點，，現(xiàn)已成為生物恐怖檢測方法的研究熱點；而膠體金免疫層析法的高靈敏度和特異度主要取決于抗原的設計和表達。 方法：本研究選取三種常見的生物恐怖因子：布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素作為研究對象，通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫和相關文獻資料選取布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素的B細胞優(yōu)勢抗原表位，加入酶切位點、His-tag標簽以及l(fā)inker，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好基因進行優(yōu)化，并轉入pET-20b原核表達載體構建重組布氏桿菌外膜蛋白抗原表達載體（pET-20b-rOmp）、重組炭疽桿菌保護性抗原表達載體（pET-20b-rPA）、重組肉毒毒素重鏈抗原表達載體（pET-20b-rHc）。通過設置不同濃度的IPTG及誘導時間，確定三種蛋白的最優(yōu)表達條件；經過超聲破碎、尿素溶解并采用SDS-PAGE鑒定，鑒定其表達形式；采用鎳離子親和層析法對于目的蛋白進行純化，并應用SDS-PAGE以及Western blot法進行鑒定，采用Western blot法鑒定三種融合蛋白的生物學活性。 結果：成功構建了pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA和pET-20b-rHc三種原核表達載體；三種蛋白的最優(yōu)表達條件為IPTG濃度為1mM，誘導時間為4h；三種蛋白均為包涵體表達，純化后三種蛋白均具有較高純度，western blot法鑒定，三種蛋白分別能夠與布氏桿菌單克隆抗體、炭疽沉淀素抗體和肉毒毒素診斷血清發(fā)生特異性反應，表明三種重組抗原在工程菌中獲得正確表達，并具有良好的生物學活性。 結論：本研究成功構建并表達了三種生物恐怖因子的優(yōu)勢抗原融合蛋白，具有良好的免疫學特性，為進一步研制三種生物恐怖因子膠體金免疫層析法同步快速檢測試紙條奠定了基礎。
【關鍵詞】：生物恐怖因子 布氏桿菌 炭疽桿菌 肉毒毒素 原核表達 親和層析 活性鑒定
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-20
• 1.1 生物恐怖概述10-11
• 1.1.1 生物恐怖10
• 1.1.2 生物恐怖因子10-11
• 1.2 布氏桿菌研究進展11-14
• 1.2.1 布氏桿菌概述11
• 1.2.2 布氏桿菌外膜蛋白研究進展11-13
• 1.2.3 布氏桿菌檢測方法研究進展13-14
• 1.3 炭疽桿菌研究進展14-16
• 1.3.1 炭疽桿菌概述14
• 1.3.2 炭疽桿菌抗原研究進展14-15
• 1.3.3 炭疽桿菌檢測方法研究進展15-16
• 1.4 肉毒毒素研究進展16-19
• 1.4.1 肉毒毒素概述16-17
• 1.4.2 肉毒毒素的結構17
• 1.4.3 肉毒毒素檢測方法研究進展17-19
• 1.5 論文研究目的與意義19-20
• 第2章 材料與方法20-31
• 2.1 實驗材料與儀器20-22
• 2.1.1 主要材料20
• 2.1.2 主要儀器20-21
• 2.1.3 試劑配制21-22
• 2.2 實驗方法22-31
• 2.2.1 布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素主要優(yōu)勢抗原表位的選取22-23
• 2.2.2 重組布氏桿菌原核載體（pET-20b-rOmp）、重組炭疽桿菌原核表達載體（pET-20b-rPA）、重組肉毒毒素原核表達載體（pET-20b-rHc）的構建23-25
• 2.2.3 原核表達載體 pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA 和pET-20b-rHc 的鑒定25
• 2.2.4 重組布氏桿菌主要優(yōu)勢抗原融合蛋白（rOmp）、炭疽桿菌主要優(yōu)勢抗原融合蛋白（rPA）和肉毒毒素主要優(yōu)勢抗原融合蛋白（rHc）的原核表達25-28
• 2.2.5 western blot 法鑒定重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的誘導表達28-29
• 2.2.6 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的純化29-30
• 2.2.7 Western blot 法鑒定純化的重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的生物學活性30-31
• 第3章 實驗結果31-49
• 3.1 布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素主要優(yōu)勢抗原表位的選取31-32
• 3.2 原核表達載體 pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA 和 pET-20b-rHc 的鑒定32-38
• 3.3 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 最優(yōu)表達條件的確定38-41
• 3.4 western blot 法鑒定重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的誘導表達41-43
• 3.5 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 表達形式的確定43-45
• 3.6 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的純化45-47
• 3.7 Western blot 法鑒定純化的重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc的生物學活性47-49
• 第4章 討論49-52
• 第5章 結論52-53
• 參考文獻53-60
• 作者簡介60-61
• 致謝61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關鍵詞：三種生物恐怖因子重組優(yōu)勢抗原表位融合蛋白的表達、純化及活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：406388