本文關(guān)鍵詞：鋅指蛋白Apak的表達(dá)與腫瘤相關(guān)性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 KZNF蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,它的蛋白結(jié)構(gòu)中包括KRAB結(jié)構(gòu)域和多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。鋅指結(jié)構(gòu)近似一個(gè)手型，可以與目的基因特異結(jié)合，一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以與3~4核苷酸相互作用，不同鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合的DNA序列不同。KRAB結(jié)構(gòu)域能夠募集組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙�；浮惾旧|(zhì)蛋白等抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。KZNF蛋白通過鋅指結(jié)構(gòu)與靶基因結(jié)合，再通過KRAB結(jié)構(gòu)域抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控。KZNF蛋白具有抑制RNA聚合酶I、II和III引物的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控核仁功能，結(jié)合與剪接RNA的功能。 Apak蛋白是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)與研究的一種KZNF蛋白，由ZNF420基因編碼，是抑癌蛋白p53的負(fù)調(diào)控分子。在正常細(xì)胞中，Apak通過輔抑制蛋白KAP1聚集組蛋白去乙�；窰DAC1和ATM激酶與p53結(jié)合形成復(fù)合體，使p53的乙�；较抡{(diào)，抑制p53相關(guān)的凋亡靶基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，而對(duì)p53參與的其它生理功能沒有明顯的調(diào)控作用。在烷化劑MMS誘導(dǎo)的DNA損傷情況下，ATM被激活，Apak的Ser68位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，磷酸化狀態(tài)的Apak與p53解離，解除了對(duì)p53的抑制作用，p53激活，細(xì)胞凋亡。 目的 探討作為KZNF家族的Apak蛋白是否有不依賴于p53的其它作用機(jī)制，Apak蛋白對(duì)細(xì)胞生長增殖有什么作用，Apak蛋白的表達(dá)與腫瘤有怎樣的相關(guān)性，希望為腫瘤的早期診斷和防治提供新的預(yù)警分子。 方法 本實(shí)驗(yàn)采取病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，選取15例胃癌患者和20例結(jié)直腸癌患者腫瘤樣本作為病例組，同一患者的腫瘤旁正常組織作為對(duì)照組，采用Westernblotting方法檢測(cè)腫瘤組織中Apak蛋白的表達(dá)水平。培養(yǎng)H1299細(xì)胞，轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四種質(zhì)粒，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)rRNA的水平，采用流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期，采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，采用ChIP方法檢測(cè)與Apak蛋白結(jié)合的DNA序列，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果 1、對(duì)本實(shí)驗(yàn)人群中的15例胃癌患者及20例結(jié)直腸癌患者的組織標(biāo)本，采用Western blotting方法檢測(cè)Apak蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)對(duì)于同一患者，與腫瘤旁正常組織相比，腫瘤組織中Apak蛋白水平下調(diào)，并且，p53突變的細(xì)胞中，Apak蛋白下調(diào)水平更顯著，說明Apak蛋白在腫瘤組織中有不依賴于p53的其它作用機(jī)制。 2、分四個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)H1299細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)rRNA的表達(dá)水平，利用Western blotting方法檢測(cè)Apak蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apak蛋白能夠抑制rRNA的合成。 3、分兩個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)H1299細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak兩種質(zhì)粒，48小時(shí)候后收細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Apak蛋白使大部分H1299細(xì)胞在G1期阻滯。 4、在H1299細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后，G418處理，2~3周后獲得穩(wěn)定表達(dá)Apak和穩(wěn)定敲低Apak的細(xì)胞系，利用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apak蛋白抑制細(xì)胞生長。 5、利用染色質(zhì)免疫沉淀方法（ChIP）發(fā)現(xiàn)Apak能夠與45SpreRNA的調(diào)控區(qū)結(jié)合，其結(jié)合的DNA序列是TCTTN2-30TTGT。 6、設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組含有兩瓶分別轉(zhuǎn)染了shRNA-con和shRNA-Apak質(zhì)粒的H1299細(xì)胞，第一組作為對(duì)照組，不加任何藥劑；第二組加入TSA；第三組加入5’-Aza，一段時(shí)間后收細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)preRNA的水平。結(jié)果表明Apak能夠使rRNA調(diào)控區(qū)發(fā)生甲基化，即Apak對(duì)rRNA調(diào)控區(qū)存在表觀遺傳學(xué)修飾。 結(jié)論 1、在腫瘤組織中Apak蛋白水平下調(diào)，并且，p53突變的細(xì)胞中，Apak蛋白下調(diào)水平更顯著。 2、Apak蛋白能夠與45SpreRNA的調(diào)控區(qū)結(jié)合。 3、Apak蛋白能夠使rRNA調(diào)控區(qū)發(fā)生甲基化，即Apak對(duì)rRNA調(diào)控區(qū)存在表觀遺傳學(xué)修飾。 4、Apak蛋白能夠抑制rRNA的合成。 5、Apak蛋白能夠抑制細(xì)胞增長，使細(xì)胞在G1期阻滯。
【關(guān)鍵詞】：KZNF Apak p53 腫瘤 KRAB 鋅指蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法12-24
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器12-16
• 2 實(shí)驗(yàn)方法16-24
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-32
• 第四章 小結(jié)32-33
• 第五章 討論33-35
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 文獻(xiàn)綜述38-43
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章43-44
• 致謝44-45

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本文編號(hào)：395133