本文關鍵詞：基于三鏈DNA分子開關的Aptamer傳感方法構建與應用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：核酸適配體與目標分子的結合能產(chǎn)生構象變化，是構建基于核酸適配體生物傳感器的核心。基于這一點，應用于生物傳感研究中的核酸適配體探針出現(xiàn)了很多的設計構型，比如單鏈的核酸適配體探針、雙鏈雜交或分子信標結構的核酸適配體探針等，然而這些設計策略都有一定的缺陷。在沒有對核酸適配體進行標記的傳感應用中，比如：無標記的單鏈核酸適配體結合電化學阻抗的方法、靜電吸附陽離子聚電解質(zhì)的方法或嵌入指示劑的方法等，無標記的核酸適配體探針雖然很好的保持了其親和力與特異性，并且有著快速、簡單、廉價等優(yōu)點，但是很難結合能夠獲得高靈敏度信號的方法，具有一定的局限性；而在有標記的核酸適配體的生物傳感應用中，其核酸適配體的特異性與親和力不僅受到了影響，而且大多為都為單一的“signal on”或“signal off”獲取信號的探針設計，在這樣的設計策略下，其信號理論值的最大值只能達到100%，其傳感器的靈敏度的提高受到了一定的限制。而三鏈DNA的構型是以Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對原理，一條核苷酸鏈通過氫鍵作用插入到雙鏈DNA結構的大溝中，平行或反平行纏繞在一起形成。我們希望利用這種特殊的DNA構型，構建新的核酸適配體探針生物傳感方法，解決其上提到的一些問題。 基于此，本論文以核酸適配體作為識別探針，利用三鏈DNA這種特殊構型，構建了兩種核酸適配體生物傳感方法來檢測生物分子。主要包括以下兩個方面的研究工作： 一、基于三鏈DNA分子開關構建核酸適配體電化學傳感平臺 本工作利用免標記的核酸適配體作為識別探針，結合三鏈DNA構型分子開關，，構建了一種方便、快速的、通用型電化學生物傳感平臺。該傳感平臺中的三鏈分子開關（APT-THDNA）包含兩個部分：一部分是作為識別元件的核酸適配體探針（APT），它是一條兩端分別延長的目標物核酸適配體；另一部分是作為信號報告的探針（STP），該部分呈發(fā)卡型結構，并在其3’與5’分別標記上了有電活性的亞甲基藍（MB）分子和巰基。其中APT的兩端延長部分可以與STP環(huán)部的堿基序列互補雜交，形成一個能特異性捕獲目標物的三鏈分子開關。當APT-THDNA分子開關修飾在電極上時，由于其剛性結構信號微弱，處于“eT off”狀態(tài)，當有目標物存在后，目標物與其核酸適配體結合，分子開關被打開，MB靠近電極，信號恢復，處于“eT on”狀態(tài)，以此信號差異檢測目標物。我們選擇人類α-凝血酶（Tmb）作為一種模式目標物被用來證明該傳感平臺的可行性，且檢測限為4.5nM；此外，為了證明該傳感平臺的普遍性，我們通過替換Tmb的核酸適配體序列為三磷酸腺苷（ATP）的核酸適配體序列后，再進行了同樣的檢測實驗，且檢測限為60nM。實驗說明該傳感平臺不僅具有選擇性，而且也具有普遍性。 二、基于三鏈DNA分子開關構建雙信號核酸適配體熒光傳感方法檢測ATP 利用核酸適配體構建了一種由目標物誘導的三鏈DNA分子開關控制實現(xiàn)雙信號“signal on”和“signal off”轉換的探針，發(fā)展了一種高靈敏而又簡便的測定ATP的熒光傳感分析方法。該核酸適配體三鏈DNA熒光探針（ATFS）由三部分的探針構成，分別是標記有熒光基團（FAM）的核酸適配體探針、標記有四甲基羅丹明（TMA）的探針以及標記有猝滅基團BHQ-2的探針；且BHQ-2探針分別與FAM探針和TMA探針雜交。沒有目標物存在時，由于FAM與BHQ-2靠近，熒光被部分猝滅，而TMA的熒光不受影響。當有ATP存在后，由于核酸適配體與目標物的識別作用，F(xiàn)AM將遠離猝滅基團BHQ-2，從而熒光恢復；與此同時之前沒有被猝滅的TMA探針將會與暴露出來的BHQ-2探針上的堿基序列雜交形成三鏈DNA結構的分子開關，使得TMA靠近BHQ-2，熒光因被猝滅而減弱。我們以這兩種熒光信號前后的變化總值為響應信號，實現(xiàn)了更靈敏地檢測目標物ATP的目的，檢測限低至1nM。若稍作序列的修改，該方法還能用于其他目標物的檢測。該熒光檢測方法操作簡便、選擇性好，且在不需要任何的放大策略的前提下提高了檢測的信號。
【關鍵詞】：核酸適配體 電化學傳感平臺 熒光傳感分析 三鏈DNA分子開關 人類α-凝血酶 三磷酸腺苷
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 本文常用英文縮略詞表11-12
• 第1章 緒論12-31
• 1.1 引言12-13
• 1.2 核酸適配體13-15
• 1.2.1 核酸適配體的概述簡介13
• 1.2.2 核酸適配體的優(yōu)勢13-14
• 1.2.3 核酸適配體的空間結構14-15
• 1.3 核酸適體在生物傳感分析中的應用15-25
• 1.3.1 生物傳感器的概述15
• 1.3.2 核酸適配體在電化學生物傳感器中的應用15-20
• 1.3.3 核酸適配體在熒光生物傳感器中的應用20-25
• 1.4 三鏈 DNA25-29
• 1.4.1 三鏈 DNA 的結構25-27
• 1.4.2 影響三鏈 DNA 穩(wěn)定性的因素27
• 1.4.3 三鏈 DNA 的分類27-29
• 1.5 本文擬開展的工作29-31
• 第2章 基于三鏈 DNA 分子開關構建核酸適配體電化學傳感平臺31-46
• 2.1 前言31-32
• 2.2 實驗部分32-35
• 2.2.1 試劑和儀器32-33
• 2.2.2 APT-THDNA 分子開關的形成33
• 2.2.3 金電極的預處理33-34
• 2.2.4 工作電極的修飾34
• 2.2.5 電化學檢測 Tmb34
• 2.2.6 電化學檢測 ATP34
• 2.2.7 通用傳感平臺的重復使用34-35
• 2.3 結果與討論35-45
• 2.3.1 檢測原理35-36
• 2.3.3 電極修飾的表征36
• 2.3.4 實驗可行性的考察36-37
• 2.3.5 實驗條件的優(yōu)化37-40
• 2.3.6 Tmb 的電化學檢測40-41
• 2.3.7 ATP 的電化學檢測41-43
• 2.3.8 選擇性實驗43
• 2.3.9 通用傳感平臺重復使用考察43-45
• 2.4 小結45-46
• 第3章 基于三鏈 DNA 分子開關構建雙信號核酸適配體熒光傳感方法檢測 ATP46-57
• 3.1 前言46-47
• 3.2 實驗部分47-49
• 3.2.1 主要儀器和試劑47-48
• 3.2.2 熒光分子探針 ATFS 的形成48
• 3.2.3 熒光掃描48
• 3.2.4 實驗可行性48-49
• 3.3 結果與討論49-56
• 3.3.1 實驗原理49-50
• 3.3.2 實驗可行性的考察50-51
• 3.3.3 實驗條件的優(yōu)化51-54
• 3.3.4 目標物 ATP 的熒光檢測54-55
• 3.3.5 選擇性實驗55-56
• 3.4 小結56-57
• 結論57-58
• 文獻引用58-64
• 致謝64-65
• 附錄A 攻讀碩士學位期間所發(fā)表的學術論文目錄65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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  本文關鍵詞：基于三鏈DNA分子開關的Aptamer傳感方法構建與應用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：364478