發(fā)布時間：2017-05-14 06:02

  本文關(guān)鍵詞：機(jī)械應(yīng)力刺激對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及細(xì)胞內(nèi)Pannexin1表達(dá)和ATP釋放的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：探索應(yīng)力刺激對細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性的影響，檢測應(yīng)力刺激下細(xì)胞內(nèi)I型膠原蛋白表達(dá)的變化，觀察應(yīng)力刺激下細(xì)胞內(nèi)pannexin1通道蛋白的表達(dá)及分布變化，檢測在應(yīng)力刺激下細(xì)胞釋放ATP的變化。 方法：實(shí)驗(yàn)于2011.8-2012.12在大連醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成。 1.取3周齡SD大鼠雌雄不限100-120克,使大鼠雙側(cè)股骨及脛骨全長充分暴露，抽取全骨髓細(xì)胞，用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)。 2.紫外分光光度計(jì)法：將細(xì)胞分為施加應(yīng)力刺激和不施加應(yīng)力刺激兩組，施加應(yīng)力刺激組刺激時間為15分鐘，4000μstrain。兩組同時將細(xì)胞消化并將細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整兩組細(xì)胞數(shù)一致，利用超生破碎（工作15s，停30s，3-4次）提取蛋白，4℃低溫離心（12000rpm，10min）取上清，用紫外分光光度計(jì)測定堿性磷酸酶（ALP）活性的差異。 3.細(xì)胞免疫化學(xué)染色法：通過對細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)力刺激干預(yù)分為兩組，施加應(yīng)力組和不加應(yīng)力組。用4％多聚甲醛將細(xì)胞固定20min，，檸檬酸鹽緩沖液對細(xì)胞進(jìn)行抗原修復(fù)10min，用0.1％Triton將細(xì)胞破膜15min，敷一抗過夜，二抗結(jié)合1h，DAB顯色10min，利用顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)I型膠原蛋白表達(dá)情況。 4.用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標(biāo)記pannexin1通道蛋白的表達(dá)和分布。 5.熒光素酶法：實(shí)驗(yàn)分為空白組，施加應(yīng)力刺激組，不加應(yīng)力刺激組。利用ATP生物熒光試劑盒檢測細(xì)胞釋放ATP的變化。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，各組間比較采用進(jìn)行單因素方差分析，概率P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P0.01具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.利用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24h后貼壁良好，48h后細(xì)胞覆蓋率約達(dá)70％-80％，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞增值迅速，傳代穩(wěn)定。 2.通過紫外分光光度計(jì)法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性，測定結(jié)果顯示施加應(yīng)力刺激組堿性磷酸酶活性增強(qiáng)。 3.利用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測細(xì)胞內(nèi)I型膠原蛋白的表達(dá)，經(jīng)過施加應(yīng)力刺激組細(xì)胞內(nèi)I型膠原蛋白的表達(dá)量增加。 4.通過熒光顯微鏡觀察到免疫熒光標(biāo)記pannexin1通道蛋白的表達(dá)及分布的變化。 5.利用ATP生物熒光試劑盒檢測到施加應(yīng)力刺激組細(xì)胞釋放ATP的量顯著增多。 結(jié)論：1.施加應(yīng)力刺激使細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，I型膠原蛋白表達(dá)量增加，從而促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。2.施加應(yīng)力刺激細(xì)胞內(nèi)免疫熒光標(biāo)記pannexin1通道蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。3.施加應(yīng)力刺激促進(jìn)細(xì)胞ATP的釋放。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 機(jī)械應(yīng)力刺激 成骨分化 pannexin1 ATP
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-12
• 材料和方法12-19
• 1．實(shí)驗(yàn)材料12-14
• 1.1 細(xì)胞來源12
• 1.2 主要試劑12
• 1.3 實(shí)驗(yàn)所用主要抗體12
• 1.4 主要儀器和耗材12-13
• 1.5 主要試劑的配制13-14
• 2.實(shí)驗(yàn)方法14-19
• 2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)14-15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組及四點(diǎn)彎曲細(xì)胞應(yīng)力加載儀15-17
• 2.3 紫外分光光度計(jì)法檢測堿性磷酸酶活性17
• 2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色法觀察 I 型膠原蛋白的表達(dá)17-18
• 2.5 細(xì)胞免疫熒光染色法利用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標(biāo)記pannexin1 通道蛋白的表達(dá)和分布18-19
• 2.6 熒光素酶法利用 ATP 生物熒光試劑盒檢測細(xì)胞釋放 ATP 的變化19
• 結(jié)果19-25
• 討論25-28
• 結(jié)論28-29
• 參考文獻(xiàn)29-32
• 綜述32-41
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 附錄41-42
• 致謝42-43

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 江凌勇;趙志河;王軍;樊瑜波;;張應(yīng)力對成骨分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ODF mRNA表達(dá)的影響[J];醫(yī)用生物力學(xué);2010年06期

  本文關(guān)鍵詞：機(jī)械應(yīng)力刺激對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及細(xì)胞內(nèi)Pannexin1表達(dá)和ATP釋放的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：364382