目的探索乙型腦炎疫苗株包膜蛋白（E蛋白）138位氨基酸向野毒株回復(fù)突變對(duì)其神經(jīng)毒力與神經(jīng)侵襲力的影響。方法采用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增含有K138E突變位點(diǎn)的DNA片段,構(gòu)建乙腦疫苗株E蛋白K138E位氨基酸突變的病毒感染性克隆,體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA,電轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞拯救病毒,繪制病毒生長(zhǎng)曲線,采用蝕斑試驗(yàn)與測(cè)序鑒定突變病毒,通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)突變病毒與疫苗株對(duì)昆明小鼠的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力。結(jié)果酶切和測(cè)序表明K138E突變病毒感染性克隆構(gòu)建成功,并通過(guò)電轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞包裝得到K138E突變病毒。蝕斑試驗(yàn)顯示突變病毒的蝕斑稍大于疫苗株,兩株病毒的生長(zhǎng)曲線與神經(jīng)侵襲力無(wú)明顯不同,但突變病毒神經(jīng)毒力顯著升高。結(jié)論乙腦疫苗株E138位氨基酸回復(fù)突變后神經(jīng)毒力增強(qiáng),E138位氨基酸是調(diào)控疫苗株神經(jīng)毒力的重要位點(diǎn)。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2019,14(07)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

圖１重疊延伸ＰＣＲ擴(kuò)增Ｋ１３８Ｅ突變ＤＮＡ片段示意圖Ｆｉｇ．１ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＫ１３８ＥｍｕｔａｎｔＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ

析，編碼Ｅ蛋白１３８位氨基酸的堿基由原來(lái)的ＡＡＡ變?yōu)椋牵粒粒耍保常福磐蛔儾《緲?gòu)建成功。１ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ１５０００）２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）３ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）經(jīng)ＨｉｎｄＩＩＩ單酶切４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）經(jīng)ＢｇｌＩＩ單酶切５ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）經(jīng)ＡｓｃＩ＋Ｘｈｏｌ雙酶切６ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）經(jīng)ＢｓｐＥＩ＋Ｘｈｏｌ雙酶切７ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ２０００）圖４ＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）突變病毒感染性克隆ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）的酶切鑒定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ１５０００）２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）３ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＨｉｎｄＩＩＩ４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＢｇｌＩＩ５ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＡｓｃＩ＋Ｘｈｏｌ６ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＢｓｐＥＩ＋Ｘｈｏｌ７ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）Ｆｉｇ．４ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃｌｏｎｅｏｆＪＥＶＫ１３８Ｅｍｕｔａｎｔ圖５ＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）突變株和疫苗株ＳＡ１４－１４－２的蝕斑比較Ｆｉｇ．５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｐｌａｑｕｅｏｆＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）ａｎｄｔｈａｔｏｆｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎ５ＪＥＶＥ蛋白Ｋ１３８Ｅ突變病毒的生長(zhǎng)特性ＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）突變株培養(yǎng)２４ｈ后，病毒滴度達(dá)４．８

ａｒｋｅｒ（ＤＬ１５０００）２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）３ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＨｉｎｄＩＩＩ４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＢｇｌＩＩ５ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＡｓｃＩ＋Ｘｈｏｌ６ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ（Ｋ１３８Ｅ）／ＢｓｐＥＩ＋Ｘｈｏｌ７ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）Ｆｉｇ．４ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃｌｏｎｅｏｆＪＥＶＫ１３８Ｅｍｕｔａｎｔ圖５ＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）突變株和疫苗株ＳＡ１４－１４－２的蝕斑比較Ｆｉｇ．５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｐｌａｑｕｅｏｆＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）ａｎｄｔｈａｔｏｆｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎ５ＪＥＶＥ蛋白Ｋ１３８Ｅ突變病毒的生長(zhǎng)特性ＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）突變株培養(yǎng)２４ｈ后，病毒滴度達(dá)４．８０ｌｏｇＰＦＵ／ｍｌ，４８ｈ時(shí)達(dá)峰值為７．４５ｌｏｇＰ－ＦＵ／ｍｌ；疫苗株病毒培養(yǎng)２４ｈ時(shí)滴度為４．４１ｌｏｇＰ－ＦＵ／ｍｌ，４８ｈ時(shí)達(dá)峰值為７．３１ｌｏｇＰＦＵ／ｍｌ，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｔ＝４．３０，Ｐ＝０．５３），且兩株病毒生長(zhǎng)曲線走勢(shì)基本一致（圖６）。６ＪＥＶＥ蛋白Ｋ１３８Ｅ突變病毒的神經(jīng)毒力及神經(jīng)侵襲力測(cè)定動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，腦內(nèi)注射和皮下注射疫苗株ＳＡ１４－１４－２均不致小鼠死亡。用腦內(nèi)注射ＳＡ１４－１４－２（Ｋ１３８Ｅ）突變株對(duì)小鼠有致死性，且小鼠出現(xiàn)典·９７３·中國(guó)病原生物學(xué)雜志Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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