本文關鍵詞：西藏小型豬糖尿病模型的建立及胰島細胞分離純化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[研究背景] 糖尿病是一組以慢性血葡萄糖(簡稱血糖)水平增高為特征的代謝疾病群。高血糖是由于胰島素分泌缺陷和(或)胰島素作用缺陷引起的。除碳水化合物外,尚有蛋白質、脂肪代謝異常。久病可引起多系統損害,病情嚴重或應激時可發(fā)生急性代謝紊亂。本病使患者生活質量降低,壽命縮短,病死率增高。國際糖尿病聯盟(IDF)的最新數據顯示,全球糖尿病患者目前已增至3.66億人,預計在20年內將達到近6億人。目前,糖尿病的治療,主要有藥物治療和胰島素注射治療,但是無論是藥物還是注射胰島素,都無法徹底根治糖尿病,病人需要終生用藥。由于多數病人存在依從性不好的問題,多數糖尿病患者得不到很好的治療,導致嚴重并發(fā)癥的出現。長期服藥或者注射胰島素,不但病人備受疾病的煎熬,而且給病人家庭帶來沉重的經濟負擔,因此,人類社會正積極尋求能夠根治糖尿病的方法。胰島移植被認為是目前治療糖尿病的有效方法之一。但胰島來源緊缺,胰島細胞供體數量不足、免疫排斥反應等,使得治療效果受到影響。 我國糖尿病病人總數世界第一,異種胰島移植治療糖尿病的研究在我國顯得更為迫切,但是和國外進行的異種胰島移植研究相比,我國的異種胰島移植研究相對落后,至今只有少數幾家單位進行過初步的臨床實驗。國內利用小型豬胰島細胞異種移植治療糖尿病的臨床前動物實驗效果觀察和安全性評價數據資料異常缺乏,嚴重阻礙了臨床應用小型豬胰島細胞異種移植治療糖尿病的開展。通過本項目的實施可掌握更多異種移植臨床前療效、毒性及安全性評價的資料,為臨床異種胰島移植研究提供堅實的實驗基礎和理論依據。小型豬作為大動物實驗常用實驗動物之一,在糖的吸收、轉運和利用方面類似于人類,豬的胰島素與人類的胰島素只差一個氨基酸,是治療糖尿病用胰島素的主要來源,豬胰島的異種移植也成為人類治療糖尿病的新方法。并且其常用血液學和血液生化指標的測定值與人類近似,隨著年齡的增長,豬可自發(fā)動脈粥樣硬化,便于人們研究糖尿病及其并發(fā)心血管疾病,為糖尿病及其并發(fā)癥的研究提供理想的動物模型。 [目的] 本研究通過藥物誘導的方法建立西藏小型豬糖尿病模型,為了糖尿病研究提供基礎資料；通過對胰島細胞分離純化,以期獲得高質量的胰島細胞,為小型豬胰島細胞臨床應用提供相關資料和經驗。 [方法] 選取健康西藏小型豬10頭,單欄飼養(yǎng),每天按動物體重的3%喂食飼料,自由飲水。小型豬隨機分為實驗組和對照組,每組各5頭。每日觀察動物飲食、飲水、行為、精神等狀況,每周稱量體重一次。小型豬用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉后,實驗組從耳緣靜脈推注鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)和四氧嘧啶(Alloxan,ALX)配置的聯合藥物,連續(xù)注射3天,對照組注入等量生理鹽水。注射前,兩組小型豬禁食12小時(由晚上22點到第二天10點)；注射后,將小型豬飼養(yǎng)在較溫暖的環(huán)境,維持體溫。實驗期間每天早晨10點用血糖儀監(jiān)測小型豬空腹血糖,連續(xù)監(jiān)測7天。造模成功后每周第一天測一次空腹血糖,直到實驗結束監(jiān)測小型豬血糖變化。每周檢測糖耐量一次。每次檢測前一天晚上22點到當天10點禁食禁水。檢測開始后,首先將75克葡萄糖粉溶于350毫升飲用水中喂給小型豬,并于飲完后30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘分別監(jiān)測血糖含量。分別在注射前一天和注射結束后第七天采集一次空腹前腔靜脈血,分離血清,采用酶法進行甘油三酯、總膽固醇測定,采用試劑盒法進行糖化血紅蛋白的測定。 選取健康的7月齡西藏小型豬,安樂死后,無菌條件下摘取西藏小型豬整個胰腺,用4℃預冷的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)浸潤,選取胰頭部位切割組織塊,將表面的被膜、結締組織和脂肪剔除,PBS沖洗,組織塊剪碎后取均分為4組,對比不同質量濃度的膠原酶(1mg/ml,2mg/ml,3mg/ml,4mg/ml)和同一質量濃度不同時間點(0min,15min,30min,45min,60min,75min,90min)分離獲得胰島細胞的數量和效果；使用Ficoll400密度梯度離心、淋巴分離液分離、離心、靜置4種方法純化胰島細胞懸液,比較最終收集到的胰島細胞數量和效果；用雙硫腙(Dithizone,DTZ)染色計算胰島細胞的純度；用吖啶橙/碘化丙啶(Acridine orange/Propidium Iodide, AO/PI)染色計算胰島細胞存活率。 [結果] 小型豬糖尿病模型制作實驗中,實驗組藥物注射后,第2天即出現高血糖,并連續(xù)7天穩(wěn)定維持在11mmol/L以上,對照組血糖未見明顯升高,兩組比較差異有顯著性意義(P0.05)。實驗組糖耐量和糖化血紅蛋白檢測都有所降低,對照組無明顯變化,在糖耐量測試結果中,有兩次超過7.0mmol/L即可判定小型豬已患糖尿病,實驗組小型豬飲用含糖飲用水后各個時間點血糖水平及空腹血糖均明顯高于7.0mmol/L,證明西藏小型豬糖尿病模型成功建立。兩組血液總膽固醇和甘油三酯水平均無明顯變化,說明STZ聯合ALX注射不能引起小型豬血脂變化,故不能用單純應用STZ聯合ALX藥物注射的方法制作高血脂動物模型。 胰島細胞分離純化確定了不同質量濃度的膠原酶獲取胰島細胞的最佳時間,膠原酶1mg/ml和2mg/ml組為45min,3mg/ml和4mg/ml組為30min,各組在最佳時間點獲得胰島細胞的數量最多的為1mg/ml組,胰島細胞形態(tài)完整,具有活性；4種純化方法中,收集的胰島細胞數量由多到少依次為靜置組Ficoll400密度梯度離心組離心組淋巴分離液離心組,4種方法獲得的胰島細胞均具有活性。經AO/PI染色后檢測胰島細胞的活度為95%以上。 [結論] 本研究成功對西藏小型豬胰島細胞進行了分離和純化的最佳條件進行了摸索和檢驗,用STZ聯合ALX的方法進行西藏小型豬糖尿病模型的建立。上述研究為糖尿病防治提供了新的動物模型和相關實驗依據。
【關鍵詞】：西藏小型豬 胰島細胞 糖尿病 鏈脲佐菌素
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R587.1;R-332
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-29
• 1 糖尿病研究現狀14-18
• 2 豬胰島細胞異種移植治療糖尿病的研究進展18-20
• 3 小型豬糖尿病模型研究現狀20-24
• 4 胰島細胞移植方法研究24-28
• 5 展望28-29
• 第一章 西藏小型豬糖尿病模型的建立29-49
• 1 材料與方法29-33
• 2 實驗結果33-45
• 3 討論45-49
• 第二章 西藏小型豬胰島細胞體外分離和純化方法49-55
• 1 材料與方法49-50
• 2 結果50-53
• 3 討論53-55
• 全文總結55-56
• 參考文獻56-61
• 附錄61-63
• 攻讀碩士學位期間主要成果63-64
• 致謝64-65

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