發(fā)布時間：2017-05-02 23:02

  本文關鍵詞：人卵泡液內FSH、LH及雌二醇對顆粒細胞NPPC基因表達的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[研究背景] 正常的減數分裂進程是保證種族延續(xù)的關鍵,是動物進化的根本保證。減數分裂對卵母細胞生長和卵泡發(fā)育有著重要作用。卵母細胞的減數分裂進程不同于精母細胞分裂進程,它是由來源于卵母細胞自身和外源性的啟動和停止信號所決定的。生殖細胞進入減數分裂后分別經歷細線期、偶線期、粗線期,最終在出生前后被阻滯在雙線期[1]。生殖細胞進入雙線期以后,才能形成原始卵泡,原始卵泡庫的形成決定生殖能力的大小。在人類和小鼠卵巢內,減數分裂從胚胎時期已經開始但停滯于第一次減數分裂雙線期。哺乳動物竇狀卵泡內完全發(fā)育成熟的卵母細胞一直停滯于減數分裂前期直至排卵前LH峰誘發(fā)第一次減數分裂恢復并誘導排卵。在生成并正確聚集那些能夠驅使自身恢復減數分裂進程的關鍵細胞周期調節(jié)分子后,停滯于減數分裂前I期的卵母細胞獲得了減數分裂恢復的能力。然而,盡管卵母細胞已經擁有已準備好的自身減數分裂途徑,可卵泡間質細胞生成的某些因子仍然能夠阻止其正常減數分裂的進行。排卵前卵泡將卵母細胞維持在減數分裂停滯狀態(tài)防止卵母細胞的過早成熟并以此保證卵母細胞胞漿和胞核同步化成熟以及卵母細胞分裂成熟與排卵行為的同步化。在正常生殖周期中,下丘腦分泌排卵前LH峰刺激格拉夫卵泡內卵母細胞的減數分裂恢復并刺激排卵。然而,單獨分離卵巢卵泡內卵母細胞并在簡單的營養(yǎng)支持培養(yǎng)條件下進行體外培養(yǎng),雖然沒有激素的刺激支持,可卵母細胞卻能夠自發(fā)恢復減數分裂。生發(fā)泡的破裂是卵母細胞減數分裂恢復的第一個明顯的形態(tài)學標志。1935年,研究者在體外培養(yǎng)家兔和人類卵母細胞實驗中首次觀察到卵母細胞自發(fā)的生發(fā)泡破裂,并提出這一觀點：從剩余的卵泡組織中分離出COC復合物造成卵泡內的減數分裂抑制因子與復合物的分離從而導致了COCs減數分裂的白發(fā)恢復[7]。隨后在其他哺乳動物研究中也相繼觀察到了卵母細胞在體外培養(yǎng)中出現的自發(fā)生發(fā)泡破裂即減數分裂恢復現象[8]。 卵母細胞需要持續(xù)穩(wěn)定升高的cAMP來維持GV期卵母細胞減數分裂的抑制狀態(tài)[9,10]。PDE3A,卵母細胞內的特異性磷酸二酯酶,在LH峰后激活,水解卵母細胞內cAMP繼而激活生長刺激蛋白并啟動減數分裂恢復信號通路,導致隨后的卵母細胞生發(fā)泡破裂[11-13]。在LH峰前,卵丘細胞所產生的cGMP通過縫隙連接轉移至卵母細胞內,抑制卵母細胞內PDE3A活性從而阻止卵母細胞內cAMP的下降和GVBD的發(fā)生[14,15]。 NPPC是一種由22個氨基酸構成的小分子多肽,在格拉夫卵泡內表達于排列在卵泡壁周圍的壁層顆粒細胞上,而它的同源受體鳥苷酰環(huán)化酶NPR2則大部分表達于環(huán)繞于卵母細胞周圍的卵丘細胞上[16]。卵泡壁層顆粒細胞內NPPC作用于卵丘細胞上NPR2受體,刺激卵丘細胞產生cGMP。將格拉夫卵泡內的COCs復合物分離出來與之共培養(yǎng)可以升高卵丘細胞和卵母細胞內的cGMP含量,阻止GVB。有研究表明,NPPC或者NPR功能缺失小鼠或者基因敲除小鼠中卵母細胞出現早發(fā)的減數分裂恢復,證實了NPPC以及其同源受體NPR2在維持減數分裂抑制中的重要作用[16]。 研究發(fā)現NPPC和它的同源受體NPR2并認為該信號系統在女性生殖系統中發(fā)揮重要作用,在減數分裂停滯狀態(tài)維持中其重要作用后,Takehito便通過研究NPPC基因缺失及NPR基因變異鼠內卵泡和卵母細胞的超微結構形態(tài),來探索生殖系統中NPPC/NPR缺乏所造成的生物學缺陷[17]。該研究者在實驗中發(fā)現,NPR缺陷小鼠排卵數量類似與正常小鼠,但所獲得的卵母細胞從未排除第一極體,所有NPR/NPPC缺陷鼠排出的卵母細胞內均存在生物學缺陷,如碎片狀或者變性退化的細胞質,并且即使受精后也無法發(fā)育至2細胞階段。組織學觀察卵巢發(fā)現NPR2以及NPPC缺陷鼠竇狀卵泡內卵母細胞發(fā)生提前減數分裂恢復,部分竇狀卵泡內的卵母和排卵前收集的卵母細胞內均表現出排列紊亂的染色體或者雜亂的染色質�；蚯贸笈怕押蟮穆涯讣毎团怕哑诼雅輧鹊穆涯讣毎鶡o卵丘細胞包繞,這些研究發(fā)現表明NPPC/NPR信號系統對卵母細胞減數分裂停滯狀態(tài)和卵丘冠狀物形成有著重要作用,并通過影響產生擁有發(fā)育潛能的卵母細胞來影響著女性生殖力。 小鼠COCs體外培養(yǎng)證實,體外培養(yǎng)過程中雌激素可以刺激并穩(wěn)定NPPC-22對卵母細胞減數分裂的抑制功能,使之上調并延長至24h。雌激素維持體外卵丘細胞受NPPC作用產生cGMP的能力,使得體外培養(yǎng)卵丘細胞反應性維持在等同于具有FSH活性的eCG刺激后新鮮獲取的卵丘細胞對NPPC的反應能力水平上[6]。然而單獨的FSH刺激在體外卵丘細胞及顆粒細胞培養(yǎng)中并無上調NPPC基因及相關表達蛋白的作用。已有國內外學者證實了小鼠排卵前LH峰能夠減少卵巢顆粒細胞分泌產生的CNP含量,減少CNP與其特異性受體NPRB結合,減少cGMP的合成而促進排卵前卵母細胞減數分裂的恢復和成熟[18]。除了通過下調NPPC/NPR2系統表達降低cGMP環(huán)核苷酸這一通路外,LH還可能通過EGF網絡系統激活MAPK激酶減少Cx43表達,關閉連接顆粒細胞與卵母細胞的縫隙連接通道,從而減少了由卵丘細胞轉移擴散至卵母細胞的cGMP流量[19]。 近幾年來國內外學者對哺乳動物卵母細胞減數分裂進程中的特殊行為進程之一即減數分裂停滯狀態(tài)進行了初步的探討。根據相關研究結果,初步形成了一個以NPPC/NPR2系統為核心的哺乳動物排卵前卵泡內卵母細胞減數分裂調控模型。該推測模型包含成員眾多(FSH, LH, EGF, MAPK, NO, T, E2, ODPFs, NPPC, NPR2, cAMP,cGMP,GPR3/12,ADCY, PDE3A),其中FSH、 E2和卵母細胞旁分泌因子ODFs可能通過刺激NPPC和或Npr2的表達增加cGMP生成來維持減數分裂抑制,而LH則可能通過EGF網絡系統或者是下調NPPC/NPR2表達來誘導該環(huán)核苷酸的降低,或者激活MAPK從而關閉連接間質細胞與卵母細胞的連接通道縫隙連接,減少由間質細胞向卵母細胞的cGMP流量。不同類型細胞間(壁層顆粒細胞,卵丘細胞,卵母細胞)以及不同信號通路間的互相對話構成了一個維持卵母細胞減數分裂抑制狀態(tài)的相互交叉、錯綜復雜的調節(jié)網絡[14,16,18-20]。但研究仍處于初步推測階段,且結果存在爭議。 近年來的研究已逐步證實在體外培養(yǎng)過程中甾體激素和促性腺激素對哺乳動物的該核心網絡具有重要的調控作用。然而必須指出的是,以往的研究并未進行卵泡生長發(fā)育過中NPPC基因表達的時間變化式以及在體狀態(tài)下不同激素對其表達狀態(tài)影響的研究。因此,本研究旨在觀察人超促排卵過程中隨著卵泡的發(fā)育NPPC基因的時間變化式,探討在體環(huán)境下影響該核心NPPC/NPR系統表達改變的相關因素,從而為進一步了解人體內卵母細胞減數分裂停滯狀態(tài)的維持及可能的調控機制,為解決生殖醫(yī)學臨床上某些卵母細胞成熟障礙或者受精障礙提供一定的實驗依據。 [目的] 檢測超促排卵過程中不同直徑卵泡內卵泡液中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素、促黃體生成素、CNP、cGMP水平,同時檢測血清中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素、促黃體生成素水平,探討各項激素與卵泡液內CNP、cGMP表達水平的相關性,并比較卵泡發(fā)育不同階段和HCG注射前后CNP、cGMP及NPPC基因表達的差異,探討在卵泡生長發(fā)育以及減數分裂恢復過程中NPPC基因表達的變化和影響NPPC基因表達的相關因素及可能的作用機制。 [方法] 選擇2012年9月—2013年1月在南方醫(yī)院生殖中心行體外受精/卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療過程中在超促排卵過程中行卵泡穿刺及取卵患者共54例。收取行治療過程中穿刺及取卵患者不同直徑的卵泡液,獲得不同直徑卵泡液共80例,分離其中顆粒細胞。根據有無注射HCG分為注射HCG組、未注射HCG組兩大組,另根據卵泡直徑大小分為四個亞組。A組為卵泡直徑直徑在10mm-12mm間卵泡,B組為卵泡直徑直徑在13mm-15mm間卵泡,C組為卵泡直徑在16mm-18mm間卵泡,D組為卵泡直徑18mm的卵泡。采用化學發(fā)光法測定血清雌二醇、孕酮、卵泡刺激素、促黃體生成素濃度,利用放射免疫法檢測各組內卵泡液中所含的雌二醇、孕酮、卵泡刺激素、促黃體生成素濃度,酶聯免疫吸附法檢測卵泡液內CNP、cGMP的濃度。最終采用q-PCR檢測不同組間的顆粒細胞內NPPC基因的表達差異及變化。 [結果] (1)各組卵泡液內激素水平檢測結果顯示：不同直徑組的雌二醇水平有顯著差異(P=0.012,P=0.014)。組內結果顯示注射HCG組與未注射HCG組其其卵泡液內雌二醇濃度均隨卵泡直徑的增加有著顯著的提高。同一直徑的注射HCG組與未注射HCG組比較：注射HCG組其卵泡液內雌二醇水平均低于未注射HCG組(P值分別為0.023,0.017,0.020,0.014)。在注射HCG組和未注射HCG組內,不同直徑組孕酮水平均無顯著差異(P=0.24,P=0.282)。在相同直徑的卵泡中,注射與未注射HCG組間其孕酮有顯著性差異(P=0.025),注射HCG組卵泡液內孕酮水平高于未注射HCG組(P值分別為0.033,0.031,0.019,0.014)。不同直徑組FSH水平無顯著差異(P=0.060)。隨著卵泡的生長發(fā)育以及卵泡直徑的增大,各組卵泡液內FSH水平并未見明顯改變,在相同直徑的卵泡中,注射與未注射HCG組間FSH水平無顯著性差異(P=0.766)。不同直徑組的LH水平無顯著差異。同一直徑的注射HCG組與未注射HCG組比較：注射HCG組其卵泡液內LH水平高于未注射HCG組(P值均為0.0000)。 (2)顆粒細胞內CNP、cGMP檢測結果顯示：不同直徑組的CNP水平有顯著差異(P=0.047,P=0.042)。各直徑組卵泡液內CNP濃度梯度為A組B組c組D組,無論是注射HCG組或者是未注射HCG組,隨著卵泡直徑的增加其卵泡液內CNP濃度均有顯著的上升。同一直徑的注射HCG組與未注射HCG組比較：注射HCG組其卵泡液內CNP水平分別為均低于于未注射HCG組(P值均為0.000)。不同直徑組cGMP水平變化與CNP變化一致,無論是注射HCG組或者是未注射HCG組,隨著卵泡直徑的增加其卵泡液內cGMP濃度均有顯著的上升(P=0.042,P=0.029)。同一直徑的注射HCG組與未注射HCG組比較：注射HCG組其卵泡液內cGMP水平低于于未注射HCG組(P值分別為0.013,0.035,0.041,0.025)。結果顯示卵泡液內CNP水平與cGMP水平變化一致,各組卵泡液內CNP水平同卵泡直徑與卵泡液內雌二醇和FSH濃度呈正相關。 (3)本研究結果顯示：不同直徑組的顆粒細胞NPPC基因表達水平有顯著差異。在未注射HCG組各個直徑組其顆粒細胞NPPC基因表達量存在顯著性差異,NPPCmRNA表達量隨著卵泡直徑的增加而上調(P=0.039),由高至低依次為：A組B組C組D組。注射HCG組各個直徑組顆粒細胞NPPC基因表達水平與未注射HCG組相似,出現表達上調現象(P=0.018).無論注射HCG與否,隨著卵泡的生長發(fā)育卵泡直徑的增加顆粒細胞內NPPC基因表達都隨之上調。同一直徑組內注射HCG36小時后與未注射HCG比較顆粒細胞NPPC基因表達量明顯下調(P=0.000)。 [結論] (1)在黃體中期長方案超促排卵過程中,卵泡內顆粒細胞分泌的卵泡液中所含的雌二醇濃度隨著卵泡直徑的增大而不斷地增加,FSH濃度同時出現上升的趨勢。卵泡液內顆粒細胞分泌產生的CNP含量、cGMP含量也隨著卵泡發(fā)育進程而不斷增加,其變化水平與雌二醇以及FSH濃度正相關。 (2)人顆粒細胞NPPCmRNA基因在卵泡早期已經出現表達,且表達量隨著卵泡的生長而逐漸上調,與CNP以及cGMP的濃度上升趨勢相吻合,與卵泡液內雌二醇濃度、FSH正相關。提示卵泡發(fā)育過程中可能通過雌二醇途徑來上調NPPC基因的表達水平,促進CNP的生成,作用于卵丘細胞合成cGMP來抑制卵母細胞內cAMP的降解。 (3)HCG刺激34-36小時后,排卵前卵泡內顆粒細胞NPPCmRNA基因的表達量出現下調,CNP較HCG注射前水平降低,cGMP合成減少,與已知的LHR受體在排卵前卵泡顆粒細胞上的高表達一致,故該結果提示人體內排卵前LH峰可能通過LHR受體途徑下調NPPC基因表達,減少下游蛋白CNP的合成,同時抑制卵丘細胞cGMP的生成,從而解除對卵母細胞內cAMP的降解抑制作用,啟動卵母細胞的減數分裂恢復。
【關鍵詞】：顆粒細胞 雌二醇 孕酮 卵泡刺激素 促黃體生成素 人C型鈉尿肽 cGMP NPPC基因 卵母減數分裂停滯狀態(tài)
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R321.1
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-24
• 第一部分 卵泡液內雌二醇、孕酮、卵泡刺激素、促黃體生成素與卵泡直徑的關系24-42
• 一、研究方法24-29
• 二、結果29-39
• 三、討論39-42
• 第二部分 不同直徑卵泡液內CNP、CGMP表達水平的變化及相關影響42-54
• 一、研究方法42-45
• 二、結果45-50
• 三、討論50-54
• 第三部分 不同直徑卵泡液內NPPC基因表達水平的變化及相關激素對其表達產生的影響54-63
• 一、研究方法54-58
• 二、結果58
• 三、討論58-63
• 綜述63-67
• 參考文獻67-71
• 縮略語表71-72
• 攻讀學位期間發(fā)表論文72-73
• 致謝73-75

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