本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌毒力和E.coli體內(nèi)生物膜形成的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：在自然界細(xì)菌以單個(gè)游離懸浮狀態(tài)和生物膜（biofilm，BF）狀態(tài)兩種形式存在。與浮游細(xì)菌相比，處于BF狀態(tài)的細(xì)菌對(duì)不利條件，如干燥、極端溫度、抗菌藥物和消毒劑的抵抗力均明顯增強(qiáng)。感染了BF的機(jī)體和污染了BF的生物材料，即使應(yīng)用正常劑量數(shù)百倍的抗菌藥物也難以奏效，因而常導(dǎo)致遷延難治性感染或嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件。傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98是一種同時(shí)編碼細(xì)菌耐藥性和毒力的“嵌合性”質(zhì)粒，在實(shí)驗(yàn)室和小鼠體內(nèi)很容易通過(guò)接合作用從傷寒沙門菌（Salmonella typhi, S. typhi, ST）傳遞至鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium, S.typhimurium, STM）、大腸埃希菌（Escherichia coli, E. coli）和痢疾桿菌等，且這些細(xì)菌彼此之間還可互相傳遞，導(dǎo)致宿主菌耐藥性和毒力增強(qiáng)。由于傷寒沙門菌只感染人類，沒(méi)有合適的動(dòng)物模型，因此在本課題中，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移將pRST98分別轉(zhuǎn)移至受體菌形成接合子STM/pRST98和E. coli/pRST98進(jìn)行研究。本研究第一部分探討傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌毒力的影響，比較受試菌STM，STM/pRST98，E. coli和E. coli/pRST98在浮游狀態(tài)和BF狀態(tài)下，細(xì)菌粘附侵襲、抵抗血清殺菌和巨噬細(xì)胞吞噬能力的的差異。本研究第二部分以E. coli和E.coli/pRST98為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建小鼠泌尿道插管模型，研究傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對(duì)E. coli在小鼠體內(nèi)形成BF的影響。 方法： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌毒力的影響 1.不同狀態(tài)下細(xì)菌菌液的準(zhǔn)備 按常規(guī)方法將受試菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98增菌，制備單個(gè)游離懸浮狀態(tài)的細(xì)菌菌液；將受試菌分別在常規(guī)條件下培養(yǎng)3d形成成熟BF，使用超聲法將BF中的細(xì)菌均勻分散后，制備BF狀態(tài)下的菌液。將游離細(xì)菌與BF細(xì)菌使用OD法和平板菌落計(jì)數(shù)法（colony-forming unit, CFU）確定濃度后，分別與小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26進(jìn)行粘附侵襲、血清殺菌以及抗巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，分別比較不同狀態(tài)下受試菌毒力的差異以及pRST98對(duì)不同狀態(tài)下宿主菌毒力的影響。 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌粘附和侵襲CT26細(xì)胞的影響 將實(shí)驗(yàn)菌株STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98按感染復(fù)數(shù)（multiplicityof infection, MOI）100:1與CT26細(xì)胞共培養(yǎng)1h后，棄去菌液后用PBS洗滌細(xì)胞，破膜后用CFU比較受試菌對(duì)細(xì)胞的粘附力。侵襲實(shí)驗(yàn)與粘附實(shí)驗(yàn)基本相同，但在細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)1h后棄去菌液用PBS洗滌3次后每孔加入含阿米卡星（100μg/ml）的細(xì)胞培養(yǎng)液，作用3h后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活菌計(jì)數(shù)。 3.傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌抵抗血清殺菌能力的影響 用OD法和CFU法將不同狀態(tài)的受試菌稀釋至1×104CFU/ml，吸取20μl菌液分別加入含不同稀釋度的兔和豚鼠血清0.2ml的試管，不含血清的普通肉湯管做CFU對(duì)照，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇37℃，2h作為殺菌作用時(shí)間。用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算存活細(xì)菌數(shù)。 4.傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌抵抗巨噬細(xì)胞吞噬殺傷的影響 STM作為兼性厭氧胞內(nèi)菌，可在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活。用OD法和CFU法將浮游狀態(tài)和BF狀態(tài)下受試菌濃度調(diào)整至107CFU/ml待用。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后將小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105個(gè)/ml，分別加入6孔板，每孔1ml。將1ml不同狀態(tài)的受試菌加入到各孔中，與細(xì)胞共作用1h。用含阿米卡星（100μg/ml）的RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌除去胞外菌，重新懸浮于含阿米卡星的培養(yǎng)液中，在不同時(shí)間點(diǎn)裂解細(xì)胞做CFU檢測(cè)胞內(nèi)活菌數(shù)。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)E. coli體內(nèi)生物膜形成的影響 1.小鼠泌尿道插管模型的制備 PE10塑料導(dǎo)管經(jīng)消毒處理后分別于1×107CFU/ml的E. coli和E. coli/pRST98菌液中浸潤(rùn)24h，使受試菌粘附于導(dǎo)管表面。雌鼠進(jìn)行麻醉、固定及消毒后，將準(zhǔn)備好的PE10導(dǎo)管插入小鼠尿道并輕推至膀胱中。根據(jù)感染細(xì)菌的不同將小鼠分為兩組，每組6只，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 2.比較E. coli和E. coli/pRST98在體內(nèi)形成BF的差異 （1）激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope， CLSM）觀察導(dǎo)管表面BF的形成 感染后第5d小鼠經(jīng)麻醉處死，將PE10導(dǎo)管從體內(nèi)取出后用PBS洗滌，置于適量濃度為0.01%的吖啶橙染液中，于黑暗中靜置染色10min再用PBS洗滌，將染色的導(dǎo)管置于載玻片上鏡下觀察。 (2)掃描電鏡（Scanning electron microscopy, SEM）觀察導(dǎo)管表面生物膜的形成 將插管后第5天的小鼠麻醉后處死，取出膀胱中的PE10導(dǎo)管，用PBS輕柔洗滌，用2.5%的戊二醛溶液固定，用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液漂洗后，用1%鋨酸后固定1h，再用連續(xù)梯度的叔丁醇溶液脫水，將導(dǎo)管取出進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥和鍍金后于SEM下觀察導(dǎo)管表面BF的形態(tài)。 (3)生物膜CFU計(jì)數(shù) 按上述方法取得導(dǎo)管后，經(jīng)PBS輕柔漂洗后置于1.0ml PBS超聲振動(dòng)20min，使生物膜中的細(xì)菌均勻分散至溶液中，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)生物膜中的活菌數(shù)量。 3.受試菌感染后小鼠臟器的變化 插入導(dǎo)管后第8d經(jīng)麻醉處死小鼠，肉眼觀察小鼠的肝臟、腎臟和脾臟的病變。取其肝臟和腎臟固定于10%的甲醛中，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等步驟，切片經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察。 結(jié)果： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌毒力的影響 1.傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下受試菌粘附和侵襲的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除E. coli外，各受試菌在BF狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞的粘附力明顯增強(qiáng)，在BF狀態(tài)和浮游狀態(tài)下，pRST98對(duì)宿主細(xì)菌的粘附力無(wú)明顯影響（p0.05）。在兩種不同狀態(tài)下，與E. coli相比，STM對(duì)CT26細(xì)胞的粘附力更強(qiáng)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，形成BF后STM對(duì)CT26細(xì)胞的侵襲力明顯下降(p 0.01)，E. coli組，也有相似趨勢(shì)(p 0.05)。另外，pRST98在BF和浮游狀態(tài)下對(duì)宿主菌侵襲CT26細(xì)胞的能力均無(wú)明顯影響。STM對(duì)CT26細(xì)胞的侵襲能力強(qiáng)于E. coli(p 0.05)。 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下受試菌抵抗血清殺菌能力的影響 BF狀態(tài)的受試菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli pRST98在兔血清和豚鼠血清中的存活率均高于浮游狀態(tài)的受試菌(p 0.05)。在BF狀態(tài)下，STM/pRST98和E.coli pRST98抗兔血清和豚鼠血清殺菌能力亦分別明顯高于STM和E. coli(p 0.05)。STM對(duì)血清殺菌的抵抗力顯著高于E. coli(p 0.05)。 3.傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下受試菌抵抗巨噬細(xì)胞吞噬殺傷的影響 BF狀態(tài)下的STM在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率明顯高于浮游狀態(tài)下的細(xì)菌，說(shuō)明在BF狀態(tài)下細(xì)菌抗巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.05）。另外，可以發(fā)現(xiàn)BF和浮游狀態(tài)下，STM pRST98在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率均高于STM（p 0.05）。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)E. coli體內(nèi)生物膜形成的影響 1.比較E. coli和E. coli/pRST98在體內(nèi)形成BF的差異 成功建立小鼠插管模型。小鼠插管后活動(dòng)正常，麻醉后處死小鼠從小鼠膀胱中取出導(dǎo)管。插管后第5d，E. coli和E. coli/pRST98可以在導(dǎo)管上形成BF，通過(guò)CLSM可以觀察到E. coli/pRST98在導(dǎo)管表面形成的BF熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于E. coli。SEM下觀察導(dǎo)管表面形成的生物膜發(fā)現(xiàn)，E. coli/pRST98感染組細(xì)菌聚集成團(tuán)，形成成片的BF，，而E. coli感染組細(xì)菌只是散落分布于導(dǎo)管表面不能形成明顯的BF。CFU定量檢測(cè)導(dǎo)管表面活菌數(shù)結(jié)果顯示，E. coli/pRST98在導(dǎo)管上的定值數(shù)量明顯高于E. coli（p 0.05）。 2.受試菌感染后小鼠臟器的變化 E. coli/pRST98感染組小鼠皮毛黯淡，精神萎靡，活動(dòng)遲緩。感染后第8d將小鼠麻醉處死解剖后見(jiàn)小鼠肝臟、腎臟和脾臟明顯充血腫大，表面有多發(fā)性小膿腫；病理切片HE染色后見(jiàn)小鼠肝臟細(xì)胞濁腫，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球結(jié)構(gòu)破壞。E. coli感染組小鼠皮毛、精神及活動(dòng)均正常，感染后第8d將小鼠麻醉處死解剖后見(jiàn)小鼠肝臟、腎臟和脾臟稍腫大，但無(wú)多發(fā)性小膿腫；病理切片HE染色可見(jiàn)小鼠肝細(xì)胞水樣變性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟細(xì)胞水樣變性及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 結(jié)論： 1. BF的形成在促進(jìn)細(xì)菌對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26粘附的同時(shí)降低了細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的侵襲。 2. BF形成能顯著增強(qiáng)細(xì)菌抵抗血清殺菌和巨噬細(xì)胞吞噬的能力，使毒力增強(qiáng)。 3.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98能增強(qiáng)浮游和BF狀態(tài)下STM和E. coli對(duì)血清殺菌和巨噬細(xì)胞吞噬的抵抗力。 4.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98能促進(jìn)E. coli在小鼠體內(nèi)形成BF。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門菌 大腸埃希菌 生物膜 傷寒沙門菌質(zhì)粒 小鼠模型
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.22
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-14
• 第一部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌毒力的影響14-29
• 前言14-16
• 1 材料與方法16-22
• 1.1 材料16-19
• 1.2 方法19-22
• 2 結(jié)果22-26
• 2.1 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下受試菌粘附 CT26 細(xì)胞的影響22
• 2.2 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下受試菌侵襲 CT26 細(xì)胞的影響22-23
• 2.3 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下受試菌抵抗血清殺菌能力的影響23-25
• 2.4 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌抵抗巨噬細(xì)胞吞噬殺傷的影響25-26
• 3 討論26-29
• 第二部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì) E. coli 體內(nèi)生物膜形成的影響29-39
• 1 材料與方法30-33
• 1.1 材料30-31
• 1.2 方法31-33
• 2. 結(jié)果33-36
• 2.1 CLSM 觀察導(dǎo)管表面細(xì)菌生物膜的形成33
• 2.2 SEM 觀察導(dǎo)管表面細(xì)菌細(xì)菌生物膜的形成33-34
• 2.3 生物膜 CFU 計(jì)數(shù)34-35
• 2.4 受試菌感染后小鼠臟器的變化35-36
• 3 討論36-39
• 小結(jié)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 綜述44-60
• References54-60
• 英文縮略詞表60-61
• 攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文61-62
• 本課題所獲基金資助62-63
• 致謝63-64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 黃瑞，穆榮譜;傷寒沙門氏菌耐藥性及其耐藥質(zhì)粒的監(jiān)測(cè)[J];中華傳染病雜志;1994年04期

  本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)菌毒力和E.coli體內(nèi)生物膜形成的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：319189