發(fā)布時間：2021-04-15 06:31

　　目的：通過新構(gòu)建的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（VSV-G／MuLV），介導(dǎo)組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plaminogen activator，tPA）基因，轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細胞，探索心肌成纖維細胞成為tPA基因治療靶細胞的可能性。 方法： 1、疹型口炎病毒殼G糖蛋白（VSV-G）替代MuLV的enV蛋白，從而產(chǎn)生一種有轉(zhuǎn)染能力的以MuLV為基礎(chǔ)的病毒載體，稱為VSV-G假型MuLV載體（VSV-G／MuLV），通過293T／17細胞共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCnBgSN、pHIT60（for gal-pol）和pCVG（for VSV-G），采用磷酸鈣共沉淀法產(chǎn)生；VSV-G／MuLV病毒生產(chǎn)細胞293／GPG的產(chǎn)生；VSV-G／MuLV病毒上清的收集及滴度測定。 2、采用兩次差速貼壁法（每次持續(xù)60分鐘）分離、培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維纖胞；通過倒置顯微鏡觀察心肌成纖維細胞的形態(tài)學(xué)特征；用免疫細胞化學(xué)染色法（SP法）鑒定心肌成纖維細胞。 3、制備含tPA基因假型病毒載體VSV-G／tPA，通過質(zhì)粒pHIT60（for gal-pol）、pCVG（for VSV-G）和... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

vsv一G/MuLv病毒滴度測定討論

無自發(fā)性搏動(圖1)。2SP免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果心肌成纖維細胞波形蛋白呈強陽性反應(yīng)，即細胞漿內(nèi)圍繞細胞核呈棕褐色顆粒狀改變，陽性率在95%以上(圖2、3);肌動蛋白呈陰性反應(yīng)，即細胞漿內(nèi)圍繞細胞核呈棕褐色顆粒狀改變數(shù)在碼以下(圖4);PBS對照呈陰性(圖5)。圖1倒置顯微鏡下心肌成纖維細胞(x40)

圖6倒置顯微鏡下心肌細胞(x40)討論1心肌成纖維細胞與心肌細胞的分離和純化心臟細胞包括心肌細胞和心肌間質(zhì)細胞，心肌間質(zhì)細胞中，心肌成纖維細胞大多數(shù)，研究心肌成纖維細胞和心肌細胞在心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展、心血管作用機制及這兩種細胞之間的相互作用，已越來越受到人們的關(guān)注。心肌成細胞與心肌細胞的分離和純化是心臟生理學(xué)研究中非常重要的一個環(huán)節(jié)，大用差速貼壁分離法。經(jīng)典的差速貼壁分離法是:用胰蛋白酶消化心肌組織所混合細胞懸液，接種在適當大小的培養(yǎng)瓶中，37℃靜置如min，輕輕振搖后尚未貼壁的心肌細胞，重新接種，可得純度大于95%的心肌細胞，而原培養(yǎng)的貼壁細胞幾乎全部為心肌成細胞，其純度也可達到大于90%。所取貼壁的各有不同。短到20min‘3’，長至3h，通常以如min多用。此方法具有操作

【參考文獻】：
期刊論文
[1]胰島素促進心肌成纖維細胞增殖和心肌細胞肥大的作用[J]. 洪華山,林嵐,王一波,江瓊,陳建華.  中國病理生理雜志. 2002(05)
[2]體外培養(yǎng)心臟成纖維細胞增殖的檢測方法[J]. 林嵐,洪華山,王一波,江瓊.  福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2000(01)
[3]風(fēng)心病患者血漿纖溶活性的變化（摘要）[J]. 熊小忠,莫樹松,王鐘林,李建明.  中華心血管病雜志. 1994(04)
[4]心血管疾病基因治療的實驗研究進展[J]. 楊水祥,李天德,黃培堂.  軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報. 1994(02)



本文編號：3138831