發(fā)布時間：2020-10-17 11:10

　　 第一部分 肺成纖維細(xì)胞中腺苷信號抑制CIITA介導(dǎo)的MHC II反式激活 目的：通過主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的高效的抗原遞呈反應(yīng)，是獲得性免疫中的一個核心環(huán)節(jié)。MHCII類反式激活蛋白啟動子IV（CIITA）被認(rèn)為是調(diào)控MHCII基因轉(zhuǎn)錄的起始最重要的調(diào)控子。在我們早期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在A2b腺苷受體缺陷的肺成纖維細(xì)胞中CIITA表達(dá)上調(diào)。因此我們得出腺苷受體激動劑NECA可以通過抑制CIITA介導(dǎo)MHC II的反式激活的假說。 方法：在本研究中，我們首先用腺苷受體激動劑（adenosine-5'N-ethylcarboxamide，NECA）處理肺成纖維細(xì)胞（IMR-90）來觀察激活了腺苷信號通路后是否能有效抑制MHCII的表達(dá)。然后我們通過抑制選擇性腺苷受體激動劑MRS-1754從而觀察其是否可以恢復(fù)CIITA依賴性的MHCII的轉(zhuǎn)錄。染色質(zhì)共沉淀的方法觀察IFN-γ處理后CIITA是否可以增加與HLA-DRα啟動子區(qū)域的結(jié)合，而ΝΕCA可以抑制CIITA與HLA-DRα啟動子區(qū)域的結(jié)合。Forskolin作為腺苷酸環(huán)化酶激動劑與NECA可以發(fā)揮同等作用。A2b信號通路通過改變組蛋白修飾以及對于III型和IV型啟動子關(guān)鍵因子的集合來抑制CIITA的轉(zhuǎn)錄，并且該調(diào)控作用是STAT1依賴性的。為了進(jìn)一步研究STAT1在腺苷信號通路的作用，我們用shRNA的方法然后觀察RNA聚合酶II和Brg1是否在CIITA的啟動子富集以及組蛋白乙�；母淖�。最后我們觀察了MRS-1754抑制腫瘤生長因子（TGF-β）的拮抗作用是否能通過免疫反應(yīng)性纖維結(jié)合素（IFN-γ）所介導(dǎo)的CIITA的表達(dá)。 結(jié)果：肺成纖維細(xì)胞中，腺苷信號通路能夠通過A2b受體抑制CIITA所介導(dǎo)的MHCII轉(zhuǎn)錄水平，F(xiàn)orskolin能夠激活腺苷酸環(huán)化酶從而抑制CIITA介導(dǎo)的MHCII的轉(zhuǎn)錄，而TGF-β通過腺苷信號通路抑制CIITA介導(dǎo)的MHCII轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論：腺苷A2b受體-腺嘌呤環(huán)化酶信號通路軸可以通過CIITA介導(dǎo)的MHC轉(zhuǎn)錄。該結(jié)論可以為新的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的思路。 第二部分 平滑肌細(xì)胞中SIRT1脫乙�；疪FX5拮抗抑制COL1A2轉(zhuǎn)錄機(jī)制的研究 目的：動脈中樣硬化斑塊中，血管平滑肌細(xì)胞中膠原含量的降低會導(dǎo)致斑塊失穩(wěn)破裂的風(fēng)險增加。根據(jù)此機(jī)制抑制I型膠原（COL1A2）可能成為一個預(yù)防斑塊破裂所帶來并發(fā)癥的潛在靶點(diǎn)。在我們以前的的研究發(fā)現(xiàn)X盒（RFX5）的調(diào)節(jié)子與COL1A2轉(zhuǎn)錄起始位置結(jié)合能夠抑制其轉(zhuǎn)錄。SIRT1作為NAD-依賴的組蛋白去乙�；福軌蛲ㄟ^調(diào)節(jié)組蛋白或者相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的乙�；絽⑴c到眾多的生物學(xué)過程中去，在本研究中我們擬觀察SIRT1作為III型組蛋白脫乙酰酶可以與RFX5形成一個復(fù)合物。 方法：通過過表達(dá)SIRT1或者NAMPT（能夠合成NAD+以激活SIRT1），或者用SIRT1拮抗劑白藜蘆醇降低RPEX5乙�；约耙种芌FX5所介導(dǎo)的COLIA2啟動子區(qū)活性。此外，我們還在細(xì)胞系中敲除SIRT1或者用SIRT1抑制劑處理細(xì)胞從而導(dǎo)致RPX5乙�；约霸黾訉τ谀z原轉(zhuǎn)錄的抑制。 結(jié)果：SIRT1能夠通過增加RFX5核轉(zhuǎn)位以及蛋白酶體的降解從而減弱其與COL1A2啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，最終拮抗RFX5活性。促炎因子IFN-γ在平滑肌細(xì)胞中可以抑制COL1A2的轉(zhuǎn)錄，其可能的機(jī)制亦是通過降低SIRT1表達(dá)。 結(jié)論：脫乙酰酶（SIRT1）在平滑肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)了COL1A2的轉(zhuǎn)錄活性，靶向作用脫乙酰酶可能成為潛在的抗動脈粥樣硬化治療的策略。因此，我們的研究為臨床上對動脈粥樣硬化進(jìn)行干預(yù)提供了潛在的靶位點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R3411
【部分圖文】：

在肺成纖維細(xì)胞中腺苷信號通路抑制 MHCII 轉(zhuǎn)錄。-90 細(xì)胞分為ΙFΝ γ處理組，不同濃度的ΝΕCA 處理組，對照組處理 24 小時后，WA）和 Q-PCR(B)分別檢測 HLA-DRα蛋白和 mRNA 水平。然后轉(zhuǎn)染 DR-a 報(bào)告再用ΙFΝ γ或者不同濃度的ΝΕCA 處理后，結(jié)果為與對照組相比相對的熒光值。3 個復(fù)孔，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ ，P <0.05）

在肺成纖維細(xì)胞中腺苷信號通路通過A2b受體抑制CIITA表達(dá)

圖 3. 在肺成纖維細(xì)胞中腺苷信號通路通過 A2b 受體繼而調(diào)控 CIITA 的表達(dá)。（A-D）IMR-90 分別用 IFN γ ，ΝΕCA 或者 MRS-1754 處理 24 小時后，用 ChIP 的方法檢測染色質(zhì)結(jié)合能力。共沉淀的 DNA 分別用 CIITA 兩個亞型 III（A,B）或者 IV(C,D)啟動子區(qū)域引物擴(kuò)增。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ ，P<0.05）
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本文編號：2844698