登革熱是由登革病毒引起，經(jīng)媒介伊蚊傳播，在世界上流行最廣泛的一種蟲媒病毒性疾病�？刂泼浇橐廖檬欠乐蜠F最有效的方法，但傳統(tǒng)上控制登革熱媒介的措施存在許多局限性，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)為蚊媒疾病的防治提供了一個新的思路。本研究擴增和克隆登革病毒C基因和prM基因，構(gòu)建了昆蟲表達載體pBhspEGFP，將prM基因以3種不同表達形式重組入昆蟲表達載體，Western Blot和熒光顯微鏡觀察證明在白紋伊蚊C6／36細胞中成功表達了prM-EGFP融合蛋白。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后C6／36細胞表現(xiàn)出對登革病毒入侵的抵抗性，從而復制出C6／36細胞對登革病毒的細胞內(nèi)免疫現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)無論是否表達prM蛋白，只要有prM基因轉(zhuǎn)錄可引起細胞內(nèi)免疫現(xiàn)象；prM基因正義和反義轉(zhuǎn)錄形式均可誘導細胞內(nèi)免疫；并探討其形成機制可能是通過RNA干擾作用而產(chǎn)生。構(gòu)建了以轉(zhuǎn)座子piggyBac因子為基礎的轉(zhuǎn)基因載體pB[PUBnls EGFP-prM]，PCR和Southern Blot證明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體可以將EGFP-prM基因整合入在蚊蟲基因組中。驗證了轉(zhuǎn)座子piggyBac因子、啟動子polyubiquitin可以在白紋伊蚊中發(fā)揮作用，為進一步構(gòu)建不傳播登革病毒的轉(zhuǎn)基因白紋伊蚊奠定了基礎。
【學位單位】：中山大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2002
【中圖分類】：R384.1;R392
【部分圖文】：

2.2質(zhì)粒pEGFp一3的Ndel和Bgl11雙酶切質(zhì)粒pEGFp一N3的Ndel和Bgl11雙酶切后產(chǎn)生與設計相符的377Pb和4.3kb兩個片段(見圖4)。圖4質(zhì)粒pEGFP一N3雙酶切后1.0%凝膠電泳圖Fig4.ResrtietionnaalysisofPlasmidPEGFP一N3(1.0%gaarosegeleleeortPhoresis)LnaeMI，MZstnaddarweightmarker，Lnael，2.PrMgenereeombinantundigestedPlasmid，Lnae3，4PlasmiddigestedbyNdel和Bgl112.2質(zhì)粒phspBac的Apal和EeoRI雙酶切質(zhì)粒phPsBac的APal和EocRI雙酶切產(chǎn)物在1.0%凝膠電泳中呈現(xiàn)在580bp和5

pB[hspEGFP]的測序鑒定化大腸桿菌JM109后，分別挑取3個克明3個克隆中有2個啟動子hsp7o呈正向插入。式pMr的表達載體pBlhsp一prM一EGFPIfs、pMr一uft、pMr一nati分別與pMr一bf配合電泳顯示pMr一ofs、pMr一uft、pMr一nati分0bp的擴增帶。

BPnati經(jīng)APal和助刀工雙酶切產(chǎn)生550Pb的插入片段，與PrM基因相符。以重組質(zhì)粒為模板做PRC鑒定，均擴增出與設計大小相符的基因片段(見圖7)。因此證明所獲得的重組質(zhì)粒已成功地插入了目的基因。圖7重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定Fig2.PCRnadRestrictionanalysisofreeombinnatPlasmid(1.2%gaarosegelelecrtoPhoersis)LnaeM1.stnaddarweightmkarerLnael，2.PCRnaalysisnadResrtietionnaalysisereombinnatPlasmidPBPrM，Lnae3，5PCRnaalysisnadResrtictionnaalysisercombinnatPlasmidPBunt，Lnae4，6PCRnaalysisandRestrietionanalysisereombinnatPlasmidPBnati4.不同表達載體pBlbsp一PrM一EGFPI在白紋伊蚊細胞C6136中的表達4.1轉(zhuǎn)染細胞的總RNA提取提取的蚊蟲細胞總NRA經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的185、285兩條泳帶，證明NRA完整無降解(見圖8)。
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