背景 近年來,干細胞因其作為生物醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)和治療性克隆技術(shù)的種子細胞,為實現(xiàn)人類健康長壽的夢想帶來了新的希望,而成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。根據(jù)干細胞的分化階段,分為胚胎干細胞(embryo stem cells,ESCs)和成體干細胞(adult stem cells,ASCs)。目前異體來源的ESCs在臨床應(yīng)用上還需要攻克細胞分化機制、免疫排斥等問題,而治療性克隆獲得的ESCs雖可以解決免疫排斥問題,但其技術(shù)復(fù)雜、離分化完全的功能細胞距離較遠。ASCs存在于成體組織中,具有來源豐富、可塑性強、離成熟細胞近和多向分化潛能等特點,而且可以實現(xiàn)個體化治療,無免疫排斥問題,因此是最具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢的種子細胞。目前已在成人骨髓、軟骨、牙髓、血液、神經(jīng)、肌肉、脂肪、皮膚、角膜緣、肝臟、胰島等多種成體組織中發(fā)現(xiàn)了干細胞�，F(xiàn)已證實成體干細胞有多向分化潛能,還可以橫向分化為不同類型的特化細胞甚至發(fā)生逆分化為更原始的干細胞。 骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)作為ASCs中最易獲得的細胞,具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層甚至內(nèi)胚層來源的組織細胞分化的能力,這些細胞包括肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、皮膚細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞等。大量研究顯示MMSCs或者造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)可在人為誘發(fā)肝臟病變后實驗鼠體內(nèi)分化為肝細胞,重建肝臟,使病鼠肝臟功能恢復(fù)正常。同時多家研究者在體外利用小鼠骨髓細胞或來自骨髓的成體多潛能干細胞在不同條件下分化為類肝細胞。MSCs具有可反復(fù)多次采集和自體移植或應(yīng)用而不出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的優(yōu)勢。如果能夠利用易于獲得的MSCs在體外誘導(dǎo)分化為成熟肝細胞,將為肝細胞移植及生物人工肝提供大量的細胞來源。 中國肝病患者眾多,對肝硬化、肝壞死或遺傳性肝臟疾病的病變部位實行細胞替代或基因轉(zhuǎn)移治療是新發(fā)展起來并極有前景的肝臟病學(xué)治療策略。適合肝臟疾病細胞治療的供體細胞應(yīng)具有以下特點:①易于獲得、培養(yǎng)、增殖,或建立細胞系;②能定向分化 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)資助項目(人肝細胞擴增分化及人源化血細胞研究,No.2001AA216161) WP=18 為所需的肝細胞或膽管上皮細胞;③移植入體內(nèi)能長期存活;④不誘導(dǎo)免疫排斥反應(yīng),對宿主無損害;⑤如果用于基因治療,目的基因可高效轉(zhuǎn)染供體細胞。MMSCs具備上述大部分條件,因此引起肝病研究者的高度關(guān)注。如果利用人自身骨髓間充質(zhì)干細胞橫向分化為肝細胞則為肝臟疾病的細胞治療提供了另一個選擇。 雖然ASCs的研究已經(jīng)取得較大進展,但在臨床上應(yīng)用還有許多問題,目前的多數(shù)實驗結(jié)果來自動物體內(nèi)實驗,而且許多是群體細胞研究,并未在克隆細胞水平得到證實。人ASCs的特性是否與動物一致,體外結(jié)果是否與體內(nèi)一致還不知道。更重要的是ASCs的分化潛能到底有多大及分化的分子機制還不十分清楚。ASCs在臨床上應(yīng)用還存在體外分離、擴增、誘導(dǎo)及體內(nèi)移植后增殖調(diào)控等技術(shù)問題。MSCs體內(nèi)移植尚不能達到大規(guī)模增殖,體外向肝細胞轉(zhuǎn)化尚未見報道。ASCs的應(yīng)用研究剛剛起步,但現(xiàn)代生物技術(shù)在ASCs相關(guān)研究中的應(yīng)用必將加快其在臨床移植修復(fù)治療中的應(yīng)用進程。 因此我們嘗試利用人胎兒MMSCs在體外向類肝細胞誘導(dǎo),觀察人胎兒MMSCs的特性,期望在成體干細胞橫向分化中作一些基礎(chǔ)研究工作。嘗試為臨床肝病治療中肝細胞來源提供新的可行性途徑。 目的 1. 建立人胎兒骨髓、臍帶血和肝臟間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分離培養(yǎng)方法,觀察細胞生物學(xué)特性和細胞表型,獲得大量的人源性MSCs。 2. 人胎兒MMSCs體外向類肝細胞誘導(dǎo)分化的條件建立及優(yōu)化。 3. 人胎兒MMSCs來源類肝細胞的分子生物學(xué)鑒定。 4. 人胎兒MMSCs來源類肝細胞的功能和超微結(jié)構(gòu)評估。 方法 1. 共收集12個人胎兒,平均孕周為18.5±4.6周,引產(chǎn)后4℃低溫保存。收集15份臍帶血。采用體外細胞培養(yǎng)技術(shù),分離培養(yǎng)人胎兒骨髓、臍帶血和肝非實質(zhì)細中MSCs,并研究其增殖及生長特征。 2. 采用體外分離培養(yǎng)的MMSCs為研究對象,設(shè)計不同的誘導(dǎo)分化條件進行體外誘導(dǎo),觀察細胞誘導(dǎo)分化過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及細胞生物學(xué)特性,應(yīng)用免疫組化檢測肝細胞標志ALB和CK18的表達,建立人胎兒MMSCs向類肝細胞分化的優(yōu)化條件。 3. 收集誘導(dǎo)培養(yǎng)第4d、7d、14d、21d、28d時的細胞爬片,SABC免疫組化法DAB顯色檢測肝細胞早期標志AFP、CK19及早期轉(zhuǎn)錄因子GATA4,成熟肝細胞標志ALB、CK18、GST-π、肝細胞轉(zhuǎn)錄因子HNF1α;提取誘導(dǎo)分化第10d和第28d細胞RNA及蛋白質(zhì),設(shè)計AFP、CK19、ALB、CK18、CYP1B1、CYP2B6引物,進行RT-PCR,觀 WP=19 察在mRNA水平肝細胞標志的表達,采用Western-Blot檢測CK18、AFP、ALB的表達量。 4. 以未誘導(dǎo)的MMSCs作對照,對誘導(dǎo)4d、7d、14d、21d、28d MMSCs采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中人白蛋白水平,脲酶法檢測合成尿素的能力,過碘酸希夫試驗進行糖原染色,電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 1. 0.5～2h內(nèi)盡快分離骨髓,24h換液后可獲得約300±80個貼壁細胞,5個細胞以上的集落為15±6個;培養(yǎng)細胞在種植后1～3d為生長滯留期,第4d達到對數(shù)生長期,以后進入到平臺期,細胞分裂指數(shù)曲線的趨勢與生長曲線基本類似,在達到對數(shù)生長期后,分裂相
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

圖 1-1-1 MMSCs 原代培養(yǎng) 40× Figure 1-1-1 MMSCs primary culture 40×圖 1-1-2 MMSCs 均等分裂 Figure 1-1-2 MMSCs equal division200× 600×

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文圖 1-1-3 MMSCs 不均等分裂 600× Figure 1-1-3 MMSCs unequal division 600×

圖 1-1-5 MMSCs 生長曲線 圖 1-1-6 MMSCs 分裂指數(shù)曲線Figure 1-1-5 MMSCs growth curve Figure 1-1-6 MMSCs divisional index curveP1 CD16692.1%P5 CD16693.6%P10 CD16693.4%P5 CD34P10 CD34P1 CD34
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王曉,李蔚,段芳齡;骨髓間充質(zhì)干細胞多能性的研究進展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2003年01期

2 賈延劼,鐘樂,宋建輝,羅芳,孫吉平,楊于嘉;體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間質(zhì)干細胞分化為胰島素分泌細胞(英文)[J];中國當代兒科雜志;2003年05期

3 奚永志,唐佩弦;成體組織干細胞的“可塑性”或“橫向分化”特性遭受重大質(zhì)疑——成體組織干細胞真的具有“橫向分化”或“可塑性”潛能?[J];中國免疫學(xué)雜志;2003年07期

4 尹雅玲,賀達仁,何群;成體干細胞可塑性研究中的若干哲學(xué)思考[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué);2004年09期

5 楊艷;汪維偉;;間充質(zhì)干細胞的可塑性研究現(xiàn)狀[J];國際移植與血液凈化雜志;2006年04期

6 鄭東;楊述華;馮勇;楊操;李進;梅榮成;唐欣;徐亮;;骨髓基質(zhì)干細胞的單克隆化培養(yǎng)和多向分化的實驗研究[J];實用骨科雜志;2007年05期

7 陸穎;王全立;王立生;吳祖澤;;脾結(jié)節(jié)形成細胞(CFU-S)向肝細胞和內(nèi)皮細胞的分化[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2009年03期

8 ;前庭學(xué)[J];中國醫(yī)學(xué)文摘.耳鼻咽喉科學(xué);1988年01期

9 魏麗華;崔海慶;王新成;李亞魯;;卵巢組織發(fā)生中間質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)觀察[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1990年03期

10 嚴恒林，沈馨亞，劉才棟，陳麗璉，汪洋，王之美;培養(yǎng)純化的人胎兒許旺細胞在脫髓鞘大鼠脊髓內(nèi)的成活和遷移[J];中國神經(jīng)科學(xué)雜志;1995年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 何念海;人胎兒間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為類肝細胞的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 廖繼東;胎肝Sca-1～+細胞的橫向分化和應(yīng)用的實驗研究[D];暨南大學(xué);2004年

3 李中騫;人肺癌變啟動研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1992年

4 王利;VIP對人造血干細胞增殖分化的影響及機制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

5 丁國斌;人胎兒表皮干細胞的分離培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染及向毛囊的定向分化[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 崔慧斐;成體組織干細胞來源依據(jù)的研究[D];山東大學(xué);2003年

7 杜園園;結(jié)膜上皮細胞在角膜基質(zhì)中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為角膜上皮樣細胞的研究[D];吉林大學(xué);2007年

8 陶克;人胎兒皮脂腺細胞和汗腺細胞的體外分離培養(yǎng)和人胎兒表皮干細胞向毛囊、皮脂腺和汗腺誘導(dǎo)分化的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

9 馬勇江;骨髓與脂肪間質(zhì)干細胞分離與誘導(dǎo)分化為成骨細胞的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

10 李華川;人食管癌組織中多種抑癌基因的變化和亞硝胺對其作用的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1993年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙豪;兔體外成骨細胞和脂肪細胞橫向分化的初步研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

2 王吉博;增強或減弱GJIC對兔脂肪細胞向成骨細胞橫向分化的影響[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2012年

3 李愛梅;大鼠骨髓間質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)橫向分化為胰島素分泌細胞的實驗研究[D];東南大學(xué);2006年

4 楊海軍;間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及其橫向誘導(dǎo)分化為角膜上皮細胞的實驗研究[D];江西醫(yī)學(xué)院;2005年

5 柴淑芳;骨髓干細胞在睪丸中橫向分化可能性的探索[D];首都師范大學(xué);2007年

6 高強;人胎兒肝干細胞—聚酸酐復(fù)合載體體外共培養(yǎng)的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

7 陸海華;骨髓間充質(zhì)干細胞肝內(nèi)移植治療肝功能損傷的實驗研究[D];東南大學(xué);2006年

8 梁亮;C-kit在人胎兒、犬和大鼠食管中的表達及意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

9 劉翠蓮;稀土離子對成骨細胞增殖、分化及礦化功能的影響[D];河北大學(xué);2009年

10 張陽敏;人胎兒骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性研究[D];蘇州大學(xué);2006年

本文編號：2845095