骨保護素(osteoprotegerin, OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族成員,它最主要的生物學作用是抑制體內破骨細胞(osteoclast, OC)的分化、活化,并促進其發(fā)生凋亡。臨床試驗及動物實驗表明,重組OPG蛋白和OPG基因治療等技術手段,對防治人及動物的骨營養(yǎng)不良性疾病具有一定的應用價值。但是關于OPG對OC的調控機制仍不完全清楚,對于OPG相關藥物的開發(fā)及其普遍運用仍存在諸多困難。本文以原代分離鴨胚OC及誘導獲取OC模型為研究對象,在體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度OPG,通過形態(tài)學鑒定、細胞活性檢測、實時熒光定量PCR (QRT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)等技術手段,研究OPG對OC分化、活性及凋亡中形態(tài)、功能、相關基因及關鍵信號蛋白的影響。本研究以期為OPG調控OC活性的機理提供理論依據。研究內容如下： 1.OPG對破骨細胞分化、活化及凋亡的影響 為了研究OPG對體外培養(yǎng)鴨胚OC分化、活化與凋亡的影響,收集23日齡鴨胚骨髓細胞,體外培養(yǎng)過程中分組加入不同濃度OPG進行處理(A組：無因子；B組：30ng/mL OPG; C組：100ng/mLOPG)。通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP),骨吸收陷窩分析,OC骨架(TRITC標記的鬼筆環(huán)肽,TRITC-conjugated phalloidin)及胞核(Hoechst33258)染色技術,檢鋇TRAP陽性細胞、OC的骨吸收活性以及OC凋亡狀態(tài)。結果顯示,三個實驗組中TRAP陽性細胞數、OC的骨吸收活性均在OPG處理7d后達到最高水平。與對照組相比,OPG處理組OC數目及OC的骨吸收活性顯著減弱(P0.05),每個時間段骨吸收陷窩凈增長面積與OC數目變化趨勢一致。OPG能夠抑制OC內纖維狀肌動蛋白環(huán)(Filamentous-actin rings, F-actin rings)的形成,并且能夠促進成熟OC內F-actin環(huán)的崩解。此外,OPG能夠誘導成熟OC發(fā)生凋亡,OC的形態(tài)及核發(fā)生改變。表明OPG能夠抑制OC細胞前體分化,促進成熟OC發(fā)生凋亡 2.OPG抑制破骨細胞分化成熟的機理 為了研究OPG抑制OC分化、活化的分子生物學機理,在無血清培養(yǎng)條件下,采用M-CSF+RANKL聯(lián)合誘導RAW264.7細胞分化為OC。在培養(yǎng)過程中加入不同濃度OPG(0、10、20、50、100ng/mL)進行處理。通過TRAP染色,OC內F-actin環(huán)染色,骨吸收陷窩分析等技術,研究OPG對OC的分化及活化的影響。此外,通過QRT-PCR技術檢測OPG對OC相關基因TRAP、RANK、MMP-9、CA Ⅱ、Cathepsin K表達量的影響。結果顯示,在無血清培養(yǎng)條件下,M-CSF+RANKL能夠誘導OC的分化與活化,并能夠促進OC分化及活化中TRAP、RANK、MMP-9、CAⅡ、Cathepsin K基因的表達,而OC的分化與活化受到OPG的抑制。 3.OPG抑制破骨細胞分化成熟的MAPK信號轉導機制 為了研究OPG抑制OC分化中的MAPK信號轉導機制,采用M-CSF+RANKL誘導RAW264.7細胞分化形成OC,在體外培養(yǎng)不同時間,各組分別添加相應濃度的OPG。各時間點培養(yǎng)結束后收集細胞,提取總蛋白,通過Western blot法檢測MAPK信號通路中關鍵信號蛋白的變化。結果發(fā)現,M-CSF+RANKL誘導RAW264.7細胞分化形成OC過程中p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三種蛋白的磷酸化水平均上升,在誘導處理15min后p38-MAPK磷酸化水平達最大值,誘導處理30min后JNK-MAPK、ERK-MAPK磷酸化水平達最大值。不同濃度OPG均能夠抑制p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三種蛋白的磷酸化水平,且隨OPG濃度的增加抑制作用更加明顯。表明MAPK信號通路參與調控OC的分化與活化過程,且參與調控OPG抑制OC的分化與活化。 4.OPG抑制破骨細胞分化成熟的Ca2+信號轉導機制 為了研究OPG抑制OC分化中的Ca2+信號轉導機制,采用M-CSF+RANKL誘導RAW264.7細胞分化形成OC,在體外培養(yǎng)不同時間,各組分別添加相應濃度的OPG。培養(yǎng)結束后收集細胞,通過流式細胞術檢測OC胞內[Ca2+]i,通過Western blot法檢測鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的磷酸化水平。結果發(fā)現,M-CSF+RANKL誘導RAW264.7細胞分化形成OC過程中OC胞內[ca2+]i極顯著升高(P0.01),CaMKIⅠ激酶磷酸化水平上升,而OPG能夠降低OC胞內[Ca2+]i,并下調CaMKIⅠ激酶的磷酸化水平。表明Ca2+信號通路參與調控OC的分化與活化過程,且參與調控OPG抑制OC的分化與活化。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：Q25

【參考文獻】

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本文編號：2821060